生物可降解纤维支架与miR-495在骨和软骨损伤修复上的应用研究

随着人类生产、生活节奏的加快,人口老龄化的加剧,骨和软骨损伤的患者呈现逐年上升的趋势。导致骨和软骨损伤的原因有很多,其中主要包括:意外事故、生产生活、骨肿瘤、先天性疾病、年龄增长等因素。在这些骨损伤的疾病中,如何治疗临界尺寸骨缺损是临床上面临的一个难题,这类骨损伤疾病很难愈合,很容易造成骨不连等后遗症。目前,临床上主要有自体骨移植、异体骨移植等治疗方法。自体骨取材来源于患者本身,虽然无免疫排斥反应,骨诱导能力强,但是来源有限,患者还要经历取骨的二次手术带来的痛苦。异体骨来源充足,可以满足临床上治疗骨缺损的大量需求,但是自体骨存在免疫排斥反应和病毒感染等风险,因此也不是骨缺损修复的最佳解决方法。为了解决上述的问题,使用骨组织工程技术制备骨缺损替代物的研究工作成为了该领域的研究的热点问题。作为骨损伤替代物应该具备以下的特点:(1)多孔结构为成骨细胞的粘附和增殖提供空间和场所,(2)具体一定的机械性能和力学强度,(3)替代物的材料应该具有良好的生物相容性和体内可吸收性,(4)具有良好的骨诱导能力,促进细胞向成骨细胞的分化。因此一个优良的临界大尺寸骨缺损替代物应该具备以上这些特性。在软骨损伤方面,本研究主要关注由软骨细胞衰老、凋亡、分化等因素导致的骨关节炎(Osteoarthritis,OA)。小分子RNA(Micro RNAs,miRNAs)作为一类内源性非编码RNA,在体内可以调控多个基因的表达,从而影响这细胞的功能。miRNAs能够和mRNA的特异性的相互作用,促进mRNA的降解并抑制mRNA的翻译,影响着相应的基因发挥作用。很多研究中已经发现在OA患者的软骨细胞中,伴随着多个miRNAs的上调和下调表达,这说明miRNAs能够参与OA的形成和病情的加剧。本研究拟从miR-495为切入点,从信号通路角度研究miR-495与OA形成的机制和关系,从而寻找一个治疗OA的新靶点。基于以上的思路,本研究的具体方案如下:(1)使用旋蝶纺丝技术,制备具有微纳米直径的骨缺损修复支架,这种技术制备的纤维支架与传统的电纺丝技术制备的纤维相比,孔隙率较高,同时具有很好的立体结构。制备纤维的材料选用的是聚乳酸-羟基乙酸共聚物(Poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和羟基磷灰石(Hydroxyapatite,HA),PLGA这种材料具有良好的生物学活性和体内可降解性,HA具有良好的骨诱导能力和体内矿化作用。从材料和制备工艺角度分析,本研究中使用的PLGA和HA能够充分满足作为骨修复替代物的要求。为了进一步改善材料表面的亲水性和细胞粘附、增殖能力,利用多巴胺分子在碱性条件下聚合形成聚多巴胺(polydopamine,PDA)的性质在纤维支架表面形成一层PDA,利用PDA的粘附能力在纤维支架上粘附骨形态发生蛋白-2(Bone morphogenetic protein-2,BMP-2)生长因子。实验结果表明PLGA纤维支架在经过PDA修饰后,表面的亲水能力得到了显著的提升,BMP-2的固定能力也得到了明显的增高,经过28天缓释的检测,经过PDA固定后的BMP-2呈现出缓慢释放的特性。以上这些结果说明我们成功的制备了一种能够缓慢释放BMP-2、亲水性好、高孔隙的骨修复支架。(2)使用MC3T3-E1细胞对支架进行细胞粘附、增殖和成骨诱导能力进行评估。PLGA组的细胞增殖率是最低的,而PLGA/HA组的细胞增殖率就明显的有所提高。这主要是由于HA能够提高材料表面的亲水性、增加表面的粗糙度,这些因素都有利于细胞的粘附和增殖。当材料表面粘附有PDA后,细胞的增殖率比未涂有PDA的组有所增加。细胞增殖率最高组发生在PDA-PLGA/HA/BMP-2。在成骨基因表达方面,PLGA/HA和PDA-PLGA/HA的RUNX2基因表达量比PLGA组提升了26%和61%。PDA-PLGA/HA/BMP-2的RUNX2基因表达量是PDA-PLGA/HA的1.25倍。以上结果说明,HA和BMP-2的引入均能够有效促进成骨相关转录因子RUNX2的表达。OPN基因在PLGA中表达最低,PDA-PLGA/HA中OPN的表达量是PLGA组中OPN的表达量的4倍,PDA-PLGA/HA/BMP-2中OPN的表达量最高。(3)评估了miR-495的高表达或下调对体外软骨细胞凋亡、生长和创伤修复的影响。结果显示miR-495的高表达可显著促进软骨细胞凋亡并抑制其增殖。miR-495的转染明显阻碍了划痕创面的修复,导致软骨细胞的损伤修复能力降低。此外,我们还观察到miR-495的转染能够促进caspase-3的活化,并进一步促进软骨细胞的凋亡。miR-495可以直接下调软骨细胞AKT1的表达,而miR-495抑制剂可有效增强AKT1的表达。因此,miR-495可能通过靶向AKT1诱导软骨细胞凋亡,AKT1过表达逆转了miR-495转染对软骨细胞凋亡、生长和创伤修复的影响。此部分研究工作为治疗由于软骨细胞凋亡导致的OA疾病提供了一个药物的新靶点。本课题研究利用旋蝶纺丝制备方法和PDA固定BMP-2技术制备了一种骨缺损修复支架,这种支架可以应用于临界尺寸骨缺损修复。同时,深入的研究了miR-495在软骨细胞凋亡、衰老等方面的作用,发现了miR-495诱导软骨细胞凋亡的分子机制。