冬虫夏草菌子实体发育起始阶段cDNA文库的构建及ESTs分析

本文从冬虫夏草分类地位、资源分布、形态特征、化学成分等几个方面阐述了目前冬虫夏草研究的概况，针对目前在冬虫夏草研究中有性过程很少研究的情况，提出了研究冬虫夏草子实体发育这一关键问题的必要性；此外，文章还详细阐述了EST技术的原理、方法、及应用，从技术层面分析了本文研究方法的可行性与合理性。在此基础上，明确了本研究的目的和意义，即通过系统的分子生物学的研究，揭示冬虫夏草菌子实体发育启动过程中关键功能基因及其代谢调控的规律，为进一步揭示其深层次生物学奥秘奠定理论基础。 研究利用实验室建立的冬虫夏草菌子实体人工培养技术体系，以分离自甘肃夏河县扎油沟产冬虫夏草的菌种为材料。分别在子实体发育启动前和子实体原基发育启动后取样，用Hibind法提取总RNA，磁珠法分离mRNA，酶切改造克隆载体，SMART cDNA LibraryConstructionKit法构建cDNA文库，在检验中间样品和文库合格后，挑选了文库的数百个克隆进行测序，并将测得的序列进行深度分析，包括：剔除污染序列，得到高质量的EST序列，通过序列聚类的方法将同一基因的EST序列聚类在一起，然后把聚类的数据进行序列拼接，得到一系列的单基因。然后，对上述单基因序列分别在NR和NT数据库中做本地blast进行基因注释；对未知基因进行开放阅读框(ORF)的预测，并对预测的ORF在interpro数据库中进行结构域和功能预测。用玉米赤霉作为背景，得到这些基因在生物过程，分子功能，细胞组件三个方面的聚类情况。此外将其与两个文库中的单基因高度同源的基因作为KEGG数据库的输入进行代谢通路的注释和分析。最后，以上述分析结果为基础，比较了冬虫夏草菌在子实体发育启动前和启动后基因表达上的差异。重点对有差异的关键基因的结构以及功能进行了深度分析。 结果显示，本研究所获得的总RNA，完整性好，纯度高，由此分离的mRNA纯度也合格。反转录的cDNA片段完整性好。进一步的全物种同源性序列比对分析表明，现有的序列与赤球丛赤壳，玉蜀黍赤霉和小麦冠腐病菌等同源性比较高。对没有任何同源序列的单基因进行开放阅读框预测，两个文库中各找了6条和5条编码蛋白，它们中大部分都含有显著的信号肽结构域或者跨膜结构。 对两个文库序列的同源基因进行GO和代谢网络分析，结果表明，这些基因无论在产物的分子功能、生物过程还是生物代谢通路中，都发挥着重要的作用。KEGG中，无论文库1和文库2都在核小体结构功能，电子传递链等代谢等通路上富集。 分析发现，在冬虫夏草菌子实体发育启动过程中，有VeA基因和HSP70基因的特异表达。并使用RACE技术从总RNA克隆到了长度为2515bp的VeA基因的cDNA。其预测蛋白质序列与丝状真菌的其他种相应预测蛋白质比对结果相似性较好。证明冬虫夏草菌中确有VeA基因。