Galectin-9/Tim-3信号对NK细胞功能的影响

目的 乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)是一种嗜肝性病毒,HBV感染会引起肝脏的一系列炎症,包括肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至引起肝癌的发生。HBV感染易形成慢性感染而难以治愈,与肝脏微环境易引起机体的免疫耐受密切相关。HBV感染早期,固有免疫细胞尤其是NK细胞是清除HBV病毒的主要效应细胞。NK细胞表面表达多种协同共刺激性分子(如CD28)和共抑制性分子(如PD-1、2B4等)。HBV慢性感染后,NK细胞表面共抑制性分子表达升高,使其功能受损进而引起机体免疫耐受不利于病毒的清除。已有研究发现,过表达HBV质粒的NK92细胞或者从HBV转基因鼠肝脏分离的NK细胞表面共抑制分子Tim-3表达升高,阻断Tim-3/Galectin-9通路后显著增强NK细胞杀伤和IFN-y产生的能力。因此,HBV慢性感染过程中Galectin-9/Tim-3信号与NK细胞功能受损密切相关。本研究首先探讨了肝细胞表面Galectin-9的表达对NK细胞功能的影响。在比较四种不同肝癌细胞系HepG2、HepG2-N1以及HBV阳性的HepG2-HBV和HepG2.2.15细胞表面Galectin-9表达差异的基础上,观察NK细胞对不同Ga-lectin-9表达水平的靶细胞的杀伤效率和产生IFN-y能力的变化,并观察Galectin-9对NK细胞凋亡的影响。另一方面,由于有研究报道Tim-3是NK细胞的共受体,因此,我们进一步探讨了Galectin-9/Tim-3信号通路的强弱不同是否对NK细胞功能产生不同的影响。一方面,在靶细胞上过表达不同水平的Galectin-9,或者利用不同浓度的重组Galectin-9蛋白刺激NK细胞;另一方面利用不同浓度的a-lactose孵育靶细胞,阻断Galectin-9-Tim-3的结合,从这两方面不同程度地改变Galectin-9/Tim-3信号的强度,观察NK细胞功能的变化。 第一部分 HBV通过上调肝细胞表面Galectin-9的表达抑制NK细胞的功能 方法 1.以HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15细胞、HBV阳性的C57BL/6小鼠原代肝细胞以及临床HBV阳性肝癌患者的肝组织为研究对象,利用RT-PCR和FACS技术,检测Galectin-9的表达。 2.与HepG2、HepG2-HBV和HepG2.2.15细胞共孵育后,MTT法检测NK细胞对其杀伤效率的变化；FACS法检测NK细胞CD107a和IFN-y的水平。 3.与HepG2和HepG2.2.15细胞共孵育后,利用FACS技术检测NK细胞发生凋亡的比例。 4.用重组人Galectin-9蛋白(rh-Galectin-9)刺激NK细胞,再将其与靶细胞共孵育,MTT法检测NK细胞杀伤效率的变化,Annexin V/PI双染法观察NK细胞的凋亡 5.用α-乳糖(a-Lactose)孵育HepG2.2.1.5细胞以结合HepG2.2.1.5细胞表而的Galectin-9,阻断Galectin-9/Tim-3信号,再将NK细胞与之孵育,MTT法观察NK细胞的杀伤效率,FACS技术检测IFN-y的产生情况。 6.通过网站预测可能调节Galectin-9表达的转录因子包括GATA-2和GATA-3。予HepG2.2.15细胞转染GATA-2和GATA-3的shRNA分别沉默GATA-2和GATA-3后,Q-PCR和FACS技术检测Galectin-9的表达;HepG2细胞过表达GATA-2后,Q-PCR和FACS技术检测Galectin-9的表达。通过网站预测出可能调节Galectin-9表达的microRNA-22、microRNA-575以及microRNA-1275; HepG2.2.15和HepG2细胞分别转染microRNA-22、 microRNA-575以及microRNA-1275的模拟物和抑制物,FACS法检测细胞表面Galectin-9表达的变化。 结果 1.与HBV阴性的HepG2细胞相比,HBV阳性的HepG2-HBV和HepG2.2.15细胞表面Galectin-9的表达显著升高。与健康对照组相比,HBV阳性鼠以及HBV阳性肝癌患者肝细胞表面Galectin-9的表达亦明显升高。 2.与HBV阴性的HepG2细胞相比,与HBV阳性的HepG2-HBV和HepG2.2.15细胞共孵育后,NK细胞对其杀伤效率明显降低,而且CD107a和IFN-y的表达水平降低。 3.与HepG2细胞相比,与HBV阳性的HepG2.2.15共孵育后,NK细胞发生凋亡的比例增加。 4. Galectin-9重组蛋白刺激过的NK细胞杀伤效率降低,发生凋亡的比例增加。 5. a-Lactose孵育HepG2.2.15细胞阻断Galectin-9/Tim-3信号通路后,NK细胞对其杀伤效率增强,IFN-y的水平显著增加。 6. HepG2.2.15细胞中转染GATA-2和GATA-3的shRNA,成功沉默GATA-2和GATA-3后,Galectin-9表达明显降低；HepG2细胞中转染GATA-2的过表达载体过表达GATA-2后,细胞表面Galectin-9的表达则明显升高。 7. microRNA-22、microRNA-575以及microRNA-1275对Galectin-9的表达没有调控作用。 结论 1,HBV阳性的肝细胞表面Galectin-9的表达明显高于HBV阴性的肝细胞。 2. Galectin-9通过与NK细胞表达的Tim-3的结合而抑制NK细胞的杀伤效率,减少IFN-y的产生,并促使其发生凋亡。 3.HBV可促进转录因子GATA-2和GATA-3的表达,GATA-2和GATA-3可能在转录水平上参与对Galectin-9表达的调控；microRNA-22、microRNA-575和microRNA-1275对Galectin-9的表达没有调控作用。 第二部分 Galectin-9-Tim-3信号的强弱对NK细胞功能的不同影响 方法 1. FACS法检测不同肿瘤细胞表面Galectin-9表达的差异。 2.与Galectin-9低、中、高表达的Raji、HL-60和Jurkat细胞共孵育后,MTT法检测NK细胞杀伤效率的变化。 3.构建Galectin-9表达质粒,分别转染至HepG2和HEK-293细胞中,RT-PCR和FACS法验证Galectin-9表达载体的过表达效果。 4. Galectin-9表达质粒转染至HEK-293细胞,再将NK细胞与之孵育,MTT法检测NK细胞杀伤效率的变化。 5.用不同浓度的Galectin-9重组蛋白(rh-Galectin-9)刺激NK细胞,再将其与靶细胞共孵育,MTT法检测NK细胞杀伤效率的变化。FACS法检测NK细胞CD107a的表达及IFN-y的产生水平。 6.用不同浓度的a-乳糖(a-Lactose)孵育HCT-116和HL-60细胞结合其表面Galectin-9以达到不同程度地阻断Galectin-9/Tim-3信号通路的目的,再将NK细胞与之孵育,MTT法检测NK细胞杀伤效率的变化。FACS法检测NK细胞CD107a的表达及IFN-y的产生水平。 7.与转染不同浓度的Galectin-9表达质粒或者转染不同时间的HepG2细胞共孵育后,MTT和CFSE/7-AAD法检测NK细胞的杀伤效率,FACS法检测NK细胞CD107a和胞内IFN-y的表达水平。 结果 1.通过FACS法检测不同肿瘤细胞表面Galectin-9的表达,将Raji、HL-60和Jurkat细胞分别定义为Galectin-9低、中、高表达的肿瘤细胞。 2.分别与Galectin-9低、中、高表达的Raji、HL-60和Jurkat细胞共孵育后,NK细胞对三种靶细胞的杀伤并没有差异。 3.构建Galectin-9表达质粒,将其转染至HepG2和HEK-293细胞中,RT-PCR和FACS法验证Galectin-9表达质粒构建成功。 4.转染Galectin-9表达质粒后,HEK-293细胞表面Galectin-9的表达明显增加,并且NK细胞对其杀伤效率明显增强。 5.随着rh-Galectin-9刺激浓度的增加,NK细胞对HepG2细胞的杀伤效率先增强后减弱。NKL细胞CD107a也呈现先增强而后有减弱的趋势。 6.当α-Lactose孵育浓度较小时,NK细胞对HCT-116和HL-60细胞的杀伤效率随着α-Lactose浓度的增加而增强；当α-Lactose孵育浓度较大时,NK细胞对HCT-116和HL-60细胞的杀伤效率减弱。 7.随着Galectin-9表达质粒转染浓度的增加,HepG2细胞表面Galectin-9的表达逐渐增加,而NK细胞对其杀伤效率先增强后减弱；Galectin-9表达质粒转染时间从24h、48h到72h,随着转染时间的延长,HepG2细胞表面Galectin-9的表达先增加后减弱,其中转染质粒24h时,Galectin-9表达较低,此时NK细胞对其杀伤效率较高。 结论 1. Galectin-9/Tim-3信号的强弱对NK细胞活化和功能的发挥产生不同的影响。 2. Galectin-9/Tim-3信号较弱时,增强NK细胞的杀伤功能；Galectin-9/Tim-3信号较强时,抑制NK细胞的杀伤功能。 3.较弱的Tim-3信号可能是NK细胞活化和发挥杀伤功能所必需的,但如果Tim-3信号过强,则会对NK功能发挥抑制作用或诱导其凋亡。