目的：胃癌是人类常见的恶性肿瘤,其死亡率在我国位居恶性肿瘤前列,中草药具有多效应、多靶点、毒副作用低、不易产生耐药性、提高机体免疫力、来源广、价格低廉等独特优点,在肿瘤治疗中具有重要地位。应用现代医学方法,探索中草药的抗肿瘤作用,提取其中的有效成分,开发具有中国特色和自主知识产权的抗癌药物,一直是人们研究的热点。目前对名老中医的单方验方的研究中,以药效学为指标,筛选最佳药物组合,分离抗癌活性单体的相关研究较少,本实验通过研究单兆伟教授抗癌名方芪竹方中重要单体山奈酚、鹤草酚B及其配伍对人胃腺癌细胞MGC-803增殖的作用、通过检测Caspase-9及端粒酶的活性来初步探讨山奈酚、鹤草酚B对人胃腺癌细胞MGC-803的作用机制,从而为研制新型抗肿瘤药物奠定基础,为临床肿瘤中药治疗用药开发和应用提供客观依据和一定的理论支持。
方法：将山奈酚、鹤草酚B分别溶于无水乙醇,初始浓度分别为2mg/mL、1mg/mL。设实验组分别为山奈酚A、B、C、D,鹤草酚B a、b、c、d组,按比例浓度配制的60、30、15、7.5μg/mL的山奈酚、鹤草酚B培养基,并以含1%无水乙醇加等容积的3%小牛血清1640培养基为阴性溶媒对照组E,125μ g/mL的5-FU为阳性对照组F。采用MTT法检测7.5-60μg/mL四种不同浓度山奈酚、鹤草酚B作用于细胞MGC-80324h、36h、48h后细胞增殖的抑制率；采用透射电镜观察山奈酚、鹤草酚B作用MGC-803细胞24h后细胞凋亡的形态学变化；采用PI标记流式细胞术检测山奈酚、鹤草酚B处理MGC-803细胞24h的凋亡率；采用分光光度法检测山奈酚、鹤草酚B作用MGC-803细胞24h后Caspase-9蛋白活化度,采用荧光定量PCR法检测山奈酚、鹤草酚B处理MGC-803细胞24h后端粒酶的活性。
结果：
1、MTT法检测提示：7.5-60μ g/mL四种不同浓度山奈酚、鹤草酚B均可以不同程度的抑制细胞增殖,山奈酚、鹤草酚B对细胞增殖的抑制作用随药物浓度增加和作用时间延长而逐渐增强,(其中最大浓度山奈酚、鹤草酚B36h、48h与阳性对照组无明显差异)加药组的抑制率与溶媒对照组比较,有明显显著性差异P<0.01)。30μ g/mL浓度的两药配伍组与单药组相比有明显差异P<0.05)。
2、经15μ g/mL、30μ g/mL浓度的山奈酚、鹤草酚B以及30μ g/mL浓度两药配伍处理后的细胞在透射电镜下观察到细胞凋亡的特征形态改变,如细胞体积缩小,胞膜皱缩,表面微绒毛消失,核固缩、沿核膜分布等。
3、流式细胞术显示：15μ g/mL、30μ g/mL浓度的山奈酚、鹤草酚B促进MGC-803细胞凋亡,作用细胞24h,在流式细胞仪上可见凋亡峰,山奈酚、鹤草酚B以及30μ g/mL的配伍组均主要使细胞周期阻滞于G1期,细胞凋亡率分别为61.17%、60.02%、29.5%、36.56%、65.88%。
4、分光光度法检测Caspase-9结果显示：15μ g/mL、30μg/mL浓度的山奈酚、鹤草酚B均可以提高MGC-803细胞Caspase-9的活化,山奈酚处理MGC-803细胞24h,Caspasc-9活性的相对含量30μ g/mL浓度组高于15μ g/mL浓度组,鹤草酚B处理MGC-803细胞24h,Caspase-9活性的相对含量30μ g/mL浓度组低于15μ g/mL浓度组,加药组与溶媒对照组Caspase-9活性的相对含量比较,有显著性差异P<0.05。两药配伍组效果与单药组有显著性差异P<0.05。
5.实时荧光定量PCR法检测15μ g/mL、30μ g/mL浓度的山奈酚、鹤草酚B处理MGC-803细胞24h后端粒酶的活性,30μ g/mL浓度组高于15μ g/mL浓度组,加药组与对照组比较有显著性差异P<0.05,西药配伍组比单药组有显著性差异P<0.05。
结论：
1、浓度为7.5-60μ g/mL四种不同浓度山奈酚、鹤草酚B处理MGC-803细胞24、36、48h,均可抑制其增殖,这种抑制增殖的作用可能是通过诱导细胞凋亡来实现的。
2、浓度为7.5-60μ g/mL四种不同浓度山奈酚、鹤草酚B处理MGC-803细胞24、36、48h,均可诱导其凋亡。
3、浓度为15μ g/mL、30μ g/mL浓度的山奈酚、鹤草酚B处理MGC-803细胞24h后可能通过活化Caspase-9,抑制端粒酶活性,从而促进其凋亡
4、30μ g/mL浓度的山奈酚、鹤草酚B两药配伍抑制增殖作用及端酶活性增强,对Caspase-9活化山奈酚作用强于鹤草酚B,且两药配伍大于单药作用。
