水通道蛋白3、4、8在大鼠慢传输便秘模型结肠黏膜中的表达

背景和目的 便秘(constipation)是一种很常见的临床症状,表现为排便次数少,或排便不畅、费力、困难、粪便干结且很少,严重影响着患者的生活质量。但是对便秘的诊治还处于探索阶段；2006年颁布的罗马Ⅲ标准对便秘的诊断做了进一步完善,对深入便秘的研究起了推动作用。便秘是由多种致病因素引起的,包括胃肠道疾病,以及累及胃肠道的其他系统疾病,不少药物也可引起便秘；其中在便秘中,功能性便秘(Functional constipation FC)疾病占大多数。同时可根据引起便秘的肠道动力和(或)肛门直肠功能的检查特点进一步将功能性便秘分为：慢传输型便秘(Slow transit constipatio n, STC)、出口梗阻型便秘(Outlet obstructive constipatio n,OOC)和混合型便秘(MIX)。其中慢传输型便秘(STC)就是一类以胃肠道动力减弱,内容物传输时间延长为主要特点的顽固性便秘,临床上主要表现为排便次数减少、无便意、排便困难、大便干燥等。有关STC的发病机制的研究表明,STC的发生是由多种因素造成的,其中包括肠道神经、平滑肌的变性异常以及心理因素和遗传因素等。在众多研究中,国内外少有报道对STC中的和肠道水份吸收相关的水通道蛋白(Aquaporin AQP)的研究,在STC患者中,肠道内容物水份被过度吸收,变得干涸,不利于内容物向前推进,进而进一步延长了排便间隔时间,并排出干燥大便。在此过程中,AQPs是否发生改变,参与了STC的发生、发展；对此研究还缺乏进一步深入。AQPs是庞大的跨膜通道蛋白(major intrinsic protein, MIP)家族中的一种。许多疾病的病理生理过程都与AQPs有关,包括白内障、肺水肿、肝硬化、先兆性子痫等。那么通过对AQPs表达及功能的调控,对治疗一些疾病提供了新的治疗途径。相关研究表明AQP3、4、8等存在于结肠,与结肠水份的吸收关系紧密,但在STC患者表达情况尚不清楚,本研究通过制造大鼠慢传输便秘模型,利用RT-PCR技术对STC组大鼠结肠黏膜上的AQP3、4、8的表达与分布情况进行测量,进而探讨其与STC关系。 材料和方法 取体重约150g的Sprague -Dawley (SD)大鼠32只,雌雄各半,由郑州大学实验动物研究中心提供,实验动物质量合格证：SCXK(豫)2005-0001。大鼠随机分为对照组(n=16)和实验组(n=16).两组体重、性别之间的差异无统计学意义；所有大鼠均单笼饲养。购得动物后7天环境适应期,实验开始前5天,每天均按0.32ml/kg BW蒸馏水灌胃,以让大鼠适应灌胃过程,减少因肠应激对实验的影响实验开始后,对照组按0.32ml/kg BW蒸馏水灌胃,模型组按8mg/kgBW予复方地芬诺酯悬溶液(0.4ml/10mg)灌胃。每5天测一次首粒黑便时间：测试前一天两组大鼠禁食不禁水12小时,于次日测定前,模型组予以复方地芬诺酯悬溶液、对照组予以蒸馏水,30分钟后灌以墨汁指示剂,然后实验组和对照组大鼠正常进食饮水,从灌墨汁时始记录每只动物首粒黑便排出时间,并对两组动物排出时间进行统计学分析直至两组时间差异有统计学意义(P<0.01),此时停药7天后再测,两组传输时间差异统计学分析仍有统计学意义(P<0.01),此时慢传输便秘模型建立。大鼠禁食不禁水12小时,3%戊巴比妥钠麻醉后,由腹正中切口入腹,截取升降结肠并刮取其黏膜,置入液氮中冻存。AQP3、4、8的检测方法：首先按照TRIZOL试剂盒的说明对保存的结肠黏膜进行总RNA的提取,然后按照逆转录试剂盒的说明合成cDNA后进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后,条带在High Performance Ultraviolet Trans illuminator(UVP)凝胶成像系统上扫描,观察扩增后的条带是否符合目的条带,然后利用Image-Pro Plus软件对电泳条带进行灰度值的测定,并取目的条带与对应的内参β-actin条带的灰度值比值作为统计数据。 结果 1.实验组和对照组的升降结肠都有AQP3的表达,其中实验组和对照组升结肠AQP3灰度比值分别为0.344±0.212、0.602±0.239。两组降结肠AQP3灰度比值分别为0.419±0.309、0.509±0.308。STC组升结肠AQP3的表达低于对照组升结肠(P<0.05),两组之间的降结肠表达无明显差异(P>0.05)。 2.两组的升降结肠都有AQP4的表达,其中在STC组和对照组升结肠的表达分别是0.764±0.544、0.759±0.629。在两组降结肠的表达分别是0.776±0.642、0.736±0.424。在两组的升结肠之间无明显差异(P>0.05)；在两组之间的降结肠之间也无明显差异。(P>0.05)。 3.AQP8在两组升降结肠无明显表达,或有少量表达。 结论 1.AQP3在两组的升降结肠都有表达,STC组升结肠表达下调,而其降结肠和对照组的降结肠黏膜相比无明显变化；提示：AQP3参与结肠水份吸收起重要作用,且主要发生在升结肠,可能对慢传输型便秘的发生、发展有一定的作用。 2.AQP4在两组结肠黏膜都有表达,且在两组升降结肠的表达无明显差异,提示：AQP4在结肠内水份吸收方面不起主要作用。 3.AQP8在两组结肠黏膜上或有少量表达,或没有表达,且两组之间表达无明显差异,提示：AQP8不参与结肠内水份吸收