低频脉冲磁场对大鼠心肌微血管内皮细胞及Cx43的影响与机制的研究

实验背景和目的 随着科技的飞速发展，电磁辐射的应用越来越广泛，各种通讯、网络、医疗设备与人的关系愈加密切，磁场的作用逐渐受到人们的重视，研究显示电磁辐射对人体产生损伤作用，相反也有研究显示电磁辐射可以作为一种安全有效的物理治疗手段，这些不同的结果，取决于电磁辐射的强度、频率、时间等。据报导，缺血性心脏病近几年来的发病率死亡率呈逐年上升的趋势，已成为威胁人类健康和生命的头号杀手[1]。缺血性心脏病的发生发展与心肌微血管内皮细胞的功能受损密切相关。因而促进内皮的再生是治疗缺血性心脏病的主要手段。微血管内皮细胞与内皮细胞在功能上有相似之处，它参与血管的再生，对改善治疗心血管疾病起到重要的作用。而细胞缝隙连接蛋白43（connexin43，Cx43）与微血管内皮细胞的生长、凋亡、迁移、炎症反应等关系密切，甚至被认为是心血管疾病发生的标志性蛋白之一[2]。因此我们可以寻找一种安全有效的电磁辐射条件，在这种条件下能够促进微血管内皮的再生，使新的血管生成，进而来治疗缺血性心脏病。本课题拟以大鼠心肌微血管内皮细胞为研究对象，旨在研究低频脉冲磁场对体外培养的心肌微血管内皮细胞和Cx43蛋白表达的影响。进一步探讨低频脉冲磁场对心肌微血管内皮细胞的作用机制，从而为临床选择合适的磁场治疗条件治疗缺血性心脏病提供理论依据和参考。 实验方法： 1．SD成年大鼠心肌微血管内皮细胞的原代培养，采用胰酶、胶原酶消化培养，差速贴壁法纯化细胞，镜下观察并对细胞表达特异蛋白VIII因子和vWF进行检测，吞噬实验对细胞进行鉴定，并用流式细胞仪检测CMECs纯度。 2．对大鼠心肌微血管内皮细胞进行低频脉冲磁场照射，将细胞分为对照组与照射组，辐照时间：4h/d，连续照射7d，频率：15Hz，场强分别为：0.8mT、1.4mT、1.8mT。用MTT法检测细胞增殖情况；流式技术检测不同磁场强度下心肌微血管内皮细胞增殖周期变化情况；用划痕实验和Transwell小室法检测不同磁场强度下心肌微血管内皮细胞的迁移能力和侵袭能力。 3.用实时定量PCR方法检测不同磁场强度下心肌微血管内皮细胞中Cx43mRNA含量变化。采用蛋白免疫印迹方法检测不同磁场强度下心肌微血管内皮细胞中缝隙连接蛋白Cx43蛋白含量变化，采用蛋白免疫印迹方法检测不同磁场强度下心肌微血管内皮细胞MAPK通路中ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的含量变化。 实验结果： 1.成功培养并纯化原代心肌微血管内皮细胞。分离纯化后镜下观察细胞呈现铺路石样特性。CMECs中特异蛋白VIII因子和vWF检测呈阳性，吞噬Dil-Ac-LDL的CMECs成红色显影，流式细胞术检测CMECs纯度为97.27±0.83%。 2.1.4mT、1.8mT低频电磁脉冲磁场可提高细胞的增殖水平，促进细胞进入到G2期、S期，促进细胞迁移和侵袭能力，与对照组比较有统计学意义（p＜0.05），1.8mT可以促进细胞分泌NO，差异有统计学意义（p＜0.05），1.4mT对细胞分泌NO的影响与对照组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。0.8mT低频电磁脉冲磁场处理后细胞增殖情况、增殖周期、迁移和侵袭能力的改变及NO的分泌与对照组比较差异无统计学意义（p＞0.05）。 3.1.4mT、1.8mT低频电磁脉冲磁场提高Cx43蛋白转录和翻译水平，提高ERK、p-ERK蛋白的水平，与对照组比较差异有统计学意义（p＜0.05)，JNK、p-JNK蛋白的水平，与对照组比较差异无统计学意义（p＞0.05)。0.8mT低频电磁脉冲磁场处理后细胞Cx43蛋白转录和翻译水平，ERK、p-ERK、JNK、p-JNK蛋白的水平与对照组比较差异均无统计学意义（p＞0.05）。 结论： 1.低频脉冲磁场可以提高心肌微血管内皮细胞的增殖能力，促进细胞进入到G2期、S期，使细胞DNA合成增多；促进细胞的迁移能力、侵袭能力；刺激细胞分泌NO。 2.低频脉冲磁场可以提高Cx43的转录水平和翻译水平，增加MAPK通路ERK、p-ERK蛋白的表达，推测低频脉冲磁场可能是通过调节Cx43的表达进而促进细胞生物能力的提高。