怀牛膝(Radix Achyranthis Bidentatae)为苋科植物牛膝(Achyranthes bidentata BL.)的干燥根,又名百倍、山苋菜、积名牛茎等,以其干燥根入药。具有有强筋骨,补肝肾,活血通经,利尿通淋,引血(火)下行等功效,临床应用历史悠久。本课题组前期研究发现并确证怀牛膝补肾壮骨的有效部位,在此基础上本文对该有效部位进行了提取工艺优化、化学拆分和药理作用研究:1、有效部位的提取工艺研究通过单因素实验确定了影响怀牛膝有效部位提取工艺的范围,应用响应面分析方法(RSM)得出怀牛膝有效部位的出膏率的优化条件为:提取溶剂为50%乙醇,提取时间4h,提取次数3次,水料比为15:1。响应面分析预测出膏率为4.53%,经三批有效部位提取实验验证,结果表明效部位实际得率与预测值极为相近。2、有效部位的拆分及互不交叉性验证研究采用D941阴离子交换树脂柱色谱对怀牛膝有效部位进行化学拆分,得到甾体组分和皂苷组分,通过UPLC-QTOF-MS 色谱手段结合PCA及OPLC-DA分析手段进行互不交叉性验证。结果表明拆分得到的甾体组分和皂苷组分互不交叉性良好。采用紫外分光光度法对各组分进行了含量测定,总甾体含量占怀牛膝甾体组分的53.3%;总皂苷含量占怀牛膝皂苷组分的64.8%。3、拆分组分的药理作用研究采用维甲酸致大鼠骨质疏松模型考察各组分对骨质疏松相关生化指标的影响,发现甾体组分可明显降低骨质疏松大鼠血清ALP、Ca2+的水平,显著提高血清中BGP和P的水平,可初步认定怀牛膝甾体组分是治疗骨质疏松大鼠的主要有效成分。采用大鼠股骨完全骨折模型,通过X光片观察,血清生化指标的测定及血液流变学检测,考察了怀牛膝各拆分组分对骨折愈合不同时期的治疗作用。X光片观察表明两个组分都可促进骨折大鼠骨折区的愈合,皂苷组分效果更为显著。生化指标检测结果表明甾体组分和皂苷组分均可不同程度升高血清ALP、BGP及Ca2+水平,降低血清P水平,其中牛膝甾体组分作用快速且持久。血液流变学检测结果发现,怀牛膝皂苷组分的血浆粘度与模型组相比明显升高,整体参数值在正常范围内变化。显示皂苷组分是发挥活血化瘀作用的主要有效组分。甾体组分和皂苷组分均可明显抑制醋酸所致小鼠的急性炎症渗出和蛋清引起的大鼠足肿胀,其中在肿胀模型中牛膝皂苷起效快,作用时间较长,抗炎作用显著。说明皂苷组分和甾体组分均为怀牛膝促进骨折愈合的有效组分,在治疗开放性骨折过程中甾体组分和皂苷组分具有协同作用。本研究完成了对怀牛膝补肾壮骨有效部位的提取]工艺考察和拆分研究,并验证了拆分得到的甾体组分和皂苷组分互不交义性良好。同时选取临床常见的骨科疾病-骨质疏松和骨折模型,对不同化学拆分组分进行骨折和骨质疏松作用研究。通过体内药理学实验确定了怀牛膝甾体组分为治疗骨质疏松的主要有效性组分。甾体组分和皂苷组分均具有治疗骨折的作用,在治疗骨折过程中呈现协同作用。本研究阐明了怀牛膝有效部位中有效组分的药理作用,体现了中药“多成分、多途径、多层次、多靶点”的作用特点。
