稀有人参皂苷compound K的制备和活性研究

人参（Panax ginseng）在我国的应用已有数千年历史,自古被列为上品,现作为名贵中药材也已闻名全世界。现代药理学研究表明,人参皂苷（ginsenoside）是人参的主要活性成分。人参皂苷compound K（CK）属二醇型稀有人参皂苷,其在天然的人参中并不存在,是其他二醇型人参皂苷在人肠道内的主要降解产物,是真正被吸收和发挥作用的实体,现已成为人参皂苷研究的新热点。但是,有关其制备和体内活性的研究还很少,更未见大规模制备的报道。 本研究在上海-SK研究与发展基金（2003001-S）,上海市科委重点项目（No.05431927）和复旦大学研究生创新基金资助下,从菌种筛选开始,完整地建立了霉菌好气性发酵转化二醇型皂苷制备人参皂苷compound K的新方法。并成功把实验室的研究成果产业化,建立了中试发酵和纯化工艺,为大规模生产稀有人参皂苷compound K奠定了扎实的基础。研究中建立了同时检测多个转化中间体的HPLC方法,从理论上具体阐述了霉菌生物转化人参皂苷Rb1至CK的主要代谢途径。报道了CK的晶体结构,并从发酵液中分离得到了另外2个新化合物和2个已知化合物;在对CK的生物活性进行研究时,不仅探讨了CK抗肿瘤活性的作用机制;还系统地进行了CK抗急性炎症、佐剂性关节炎和Ⅱ型胶原诱导的类风湿性关节炎的药效研究,发现了CK在该方面的新的显著活性。以上研究结果均为CK一类新药开发奠定了基础。具体结果如下: 1、本研究共从采集到的土样中分离得到306株霉菌,筛选到了新的高转化菌株Paecilomyces Bainier sp.229,并进行了紫外诱变。 2、本研究采用单因素筛选和正交优化相结合的方法,对碳、氮源,生长因子及金属离子进行了配比优化,确定最佳培养基配方,CK克分子转化率从原始培养基的21%提高到了51%左右。并对其它发酵条件进行了考察,通过确定最佳发酵温度、pH、发酵时间、通气量、接种量、底物投料量及表面活性剂等,使转化率进一步提高到72.7%,大大高于文献报道值。 3、本研究首次建立了发酵转化过程中,中间代谢产物同时检测的HPLC分析方法,并通过线性、灵敏度、准确性以及精密度进行了方法验证。利用该方法进行了代谢途径的研究,结果表明Paecilomyces Bainier sp.229发酵转化Rb1生成CK的主要代谢途径是Rb1→Rd→F2→CK,并首次报道了各个代谢物在转化过程中的变化曲线,为今后继续深入进行代谢调控研究奠定了基础。 4、为适应工业化生产,本研究首次建立了三级发酵的中试工艺,筛选了一、二级种子培养基和发酵培养基。通过pH调节,溶氧-转速关联,以及底物诱导等一系列关键点控制,10L发酵罐转化率最终达到75.47%,连续三批50 L中试放大实验,转化率最高达到83.22%。同时本研究建立了适用于中试放大生产的CK纯化工艺,总收率达到65%以上,最终产品的纯度可以达到92%以上。以上研究建立了我国独特的工业化生产人参皂苷compound K的新工艺。 5、本研究首次对CK进行了X-ray单晶衍射分析,研究了其晶体学结构。其A环和B环都是高度对称的椅式构象,C环由于受到C12羟基的拉伸和五元D环的张力,形成了扭曲的椅式构象,而D环采用13α,14β-半椅式构象。为进一步进行CK构效关系研究提供了重要数据。 6、本研究运用常规硅胶柱分离和半制备高效液相分离相相结合的方法,从发酵液中分离到其他2个已知化合物,2个新化合物。经ESI-MS,1H、13C-NMR,DEPT,HSQC及HMBC谱分析鉴定,两个已知化合物分别是PPT和Rh1。两个新化合物中,NewⅠ是C3位连有羰基的二醇型人参皂苷,NewⅡ则是在侧链C25上引入了过氧羟基,双键移到C23-C24位置的二醇型人参皂苷。 7、本研究进行了CK体外肿瘤细胞增殖抑制试验,结果显示其对不同肿瘤细胞均有较为显著的增殖抑制作用,并呈明显的量效关系。体内抗肿瘤药效试验结果表明,CK单独用药抑制肿瘤生长的效果一般,但与化疗药物联用时具有明显的增效作用,抑制率可达66%。抗肿瘤机制研究表明,CK与CTX联用时,可以明显改善CTX对WBC、IL-2、TNF-γ和胸腺系数的抑制,CK既可提高化疗药物的药效,同时可提高机体免疫力,降低化疗药物引起的毒性。 8、本研究考察了CK在抗关节炎方面的活性,发现其对大鼠足趾急性炎症的抑制率达到78.23%;对大鼠佐剂性关节炎预防作用的抑制率为31.26%,治疗作用的抑制率可达36.15%,均明显高于消炎痛和雷公藤。对Ⅱ型胶原诱导的大鼠类风湿性关节炎预防作用,抑制率最高可达48.29%;治疗作用,抑制率最高达36.15%,均显著优于Enbrel和雷公藤。本研究是首次发现了CK在治疗关节炎方面的显著活性,为CK的新药开发提供了新方向。