目的:优化桦褐孔菌多糖的提取工艺,研究桦褐孔菌多糖对依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞衰老的保护作用及机制。方法:(1)水提醇沉法提取桦褐孔菌多糖成分。在单因素实验的基础上,采用Box-Behnken响应面法(BBD-RSM)优化桦褐孔菌多糖提取工艺,研究提取温度、提取时间、液料比等提取参数及交互作用对桦褐孔菌多糖得率的影响;?KTA explorer 100层析系统结合DEAE-纤维素离子交换层析和琼脂糖CL-6B凝胶过滤层析对桦褐孔菌多糖进行分级纯化。(2)建立体外抗氧化模型(DPPH自由基清除实验、ABTS总抗氧化能力测定实验和FRAP铁离子还原能力测定实验)对不同级分的桦褐孔菌多糖进行抗氧化活性筛选。(3)构建大鼠主动脉平滑肌细胞衰老模型,采用MTT法、形态学观察、衰老β-半乳糖苷酶染色法、DAPI染色法研究桦褐孔菌多糖对依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞衰老的保护作用。(4)采用ROS检测实验、线粒体膜电位检测实验研究桦褐孔菌多糖对依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞氧化应激的抑制作用。(5)采用qRT-PCR、Western blot方法分别在mRNA水平、蛋白质水平检测桦褐孔菌多糖对依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞衰老相关基因p53、p21和p16表达的影响。结果:(1)桦褐孔菌多糖的最佳提取条件为:提取温度100℃、提取时间2.39 h,液料比35.8:1 mL/g,最大得率为11.21%;分级纯化得到两种桦褐孔菌多糖,即中性多糖IOP-1和酸性多糖IOP-2。(2)体外抗氧化实验表明:IOP-1和IOP-2均具有体外抗氧化活性,包括DPPH自由基清除能力、ABTS总抗氧化能力和FRAP铁离子还原能力,IOP-1的体外抗氧化活性均强于IOP-2和阳性对照维生素E。在0.025～1.6 mg/mL浓度范围内,IOP-1在浓度为0.2 mg/mL时对DPPH自由基清除率达到83.39±0.03%,强于1.6 mg/mL浓度下的IOP-2和维生素E的DPPH自由基清除率73.74±0.04%和39.15±0.03%(p<0.05);IOP-1在浓度为0.4 mg/mL时的ABTS总抗氧化能力为1.39±0.08 mmoL/g,强于IOP-2和维生素E在1.6 mg/mL浓度下的总抗氧化能力1.08±0.07 mmoL/g和0.38±0.12 mmoL/g(p<0.05);在1.6 mg/mL浓度下,IOP-1的铁离子还原能力为1.15±0.10 mmoL/g,强于同样浓度下的IOP-2和维生素E的铁离子还原能力0.75±0.07 mmoL/g和0.22±0.04 mmoL/g(p<0.05)。(3)IOP-1具有促进大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的作用,可抑制依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖阻滞,提高细胞活力,并抑制依托泊苷诱导的A10细胞衰老形态学变化、衰老β-半乳糖苷酶活性和衰老相关异染色质聚集。(4)IOP-1通过抑制由依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞ROS的生成和线粒体膜电位的下降而抑制氧化应激。(5)IOP-1通过抑制由依托泊苷诱导的衰老相关基因p53、p21和p16的表达而保护大鼠主动脉平滑肌细胞衰老。结论:明确了桦褐孔菌多糖的最佳提取工艺;筛选了具有体外抗氧化活性的桦褐孔菌中性多糖组分IOP-1;IOP-1抑制依托泊苷诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞衰老表型,并通过抑制ROS生成和平衡线粒体膜电位抑制氧化应激,其分子机制为调控经典衰老相关信号通路p53-p21、p16-pRb中衰老相关基因p53、p21以及p16的高表达。
