肾素抑制剂对高糖诱导足细胞凋亡与mTOR表达的影响

背景慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)是严重威胁人民身体健康且消耗巨大社会资源的常见疾病,最近的调查显示国内CKD患病率约为10.8%,由于其致病因素广泛,其发病率一直居高不下,且有逐年上升的趋势,其高死亡率、高致残率、高社会成本支出、低知晓率也同样令人关注。糖尿病肾病是慢性肾脏病的主要病因之一,在全球有约3亿糖尿病病人,其中约30%发展为糖尿病肾病,恩施地区也属于糖尿病高发区,根据恩施土家族苗族自治州血液净化统计资料,透析病人中糖尿病肾病占14.9%。肾脏血流动力学变化、肾脏微血管病变、小球系膜细胞及基质增生等曾被认为是糖尿病肾病的主要病理生理变化,近年随着对足细胞的深入研究,认为足细胞损伤、足细胞功能改变、足细胞过度凋亡与糖尿病肾病的蛋白尿、肾小球硬化密切相关,足细胞受损是糖尿病肾病发展的关键,因此有学者认为糖尿病肾病的本质就是足细胞病。 肾素血管紧张素系统(RAS)的激活与糖尿病肾病的发生与发展关系密切,在RAS与糖尿病肾病足细胞受损之间的复杂网络关系中,PI3K-AKT-mTOR信号传导途径起着重要作用,mTOR的活化能减少足细胞自噬,促进足细胞凋亡。虽然糖尿病肾病时观察到了足细胞mTOR信号通路的活化及足细胞损伤,以及阻断mTOR信号系统带来的益处,但足细胞mTOR信号通路具体调控过程还在探索中,糖尿病时高糖能否直接活化足细胞mTOR信号通路、导致足细胞凋亡目前也不清楚。肾脏局部的RAS系统除了通过影响肾脏的血流动力学外,还影响尿蛋白排泄、系膜基质增生、小管间质纤维化,而足细胞作为糖尿病肾病病变的核心,不仅是RAS引起损伤作用的靶目标,亦是局部RAS的重要来源,RAS激活对足细胞本身的影响目前尚未完全明了,特别是对足细胞凋亡、足细胞mTOR信号通路的影响研究更少。 目的观察高糖诱导足细胞mTOR表达及凋亡改变以及肾素抑制剂对其的影响。 方法1.将培养的成熟足细胞分为对照组、高渗组、高糖组,对照组置于含5mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养液,高渗组为含5mmol/L葡萄糖、25mmol/L甘露醇的RPMI1640培养液,高糖组为含30mmol/L葡萄糖的RPMI1640培养液。各组足细胞培养24小时后应用RT-PCR测定各组mTOR mRNA表达,Western blot测定各组足细胞mTOR蛋白表达,TUNEL法测定各组足细胞凋亡率。2.将培养足细胞分为对照组、无义转染组、siRNA转染组,转染组加入转染试剂(Lipofecter旨质体)、mTOR siRNA进行转染,无义对照组加入转染试剂、对照(无义)siRNA,空白对照组仅加转染试剂(空脂质体)。按转染试剂盒说明书转染24小时,将转染成功后的足细胞置于含30mmol/L葡萄糖RPMI1640培养液继续培养24小时。通过RT-PCR测定各组mTOR mRNA表达,Western blot测定各组足细胞mTOR蛋白表达,TUNEL法测定各组足细胞凋亡率。3.将培养的足细胞分为对照组、低剂量Aliskiren组(含10nmol/L的Aliskiren)、中剂量Aliskiren组(含20nmol/L的Aliskiren)、高剂量Aliskiren组(含30nmol/L的Aliskiren),在30mmol/L葡萄糖RPMI1640培养液培养24小时后应用RT-PCR测定各组mTOR mRNA表达,Western blot测定各组足细胞mTOR蛋白表达,TUNEL法测定各组足细胞凋亡。 结果在高糖刺激下,足细胞表达mTOR mRNA较高渗组及对照组显著上调(P<0.01),mTOR蛋白表达也显著上调(P<0.01),足细胞凋亡高于高渗组及对照组(P<0.01)。应用siRNA技术沉默mTOR基因表达后,足细胞mTOR mRNA及mTOR蛋白均较对照组和无义转染组显著下调(P<0.01),转染组在高糖刺激下足细胞凋亡率显著下降(P<0.05)。给予肾素抑制剂Aliskiren干预后,足细胞mTOR蛋白表达较对照组下调(P<0.01),足细胞凋亡也较对照组下降(P<0.01),随着干预剂量的增加,其mTOR蛋白表达下调更加显著,三组剂量组间有统计学差异(P<0.05)。 结论高糖可能通过上调足细胞mTOR表达诱导其凋亡；肾素抑制剂对足细胞的保护作用可能与其下调足细胞mTOR表达,减少高糖刺激下的足细胞凋亡有关。 目的观察肾素抑制剂Aliskiren对糖尿病肾病大鼠肾脏mTOR表达、尿液足细胞排泄的影响。 方法40只Wistar大鼠采用腹腔内一次性注射STZ制作糖尿病模型,随机分糖尿病组及Aliskiren治疗组,另20只正常Wistar大鼠作为对照组,Aliskiren治疗组每日给予Aliskiren10mg/kg一次性灌胃,8周后留取尿液计数各组大鼠尿液足细胞排泄数；取大鼠肾皮质,RT-PCR测定各组大鼠肾脏mTORmRNA表达,Western blot测定mTOR蛋白表达。 结果糖尿病大鼠尿液足细胞排泄显著高于对照组(P<0.01),应用Aliskiren干预8周后,糖尿病大鼠足细胞排泄明显减少(P<0.01)；糖尿病大鼠肾组织mTOR表达显著高于对照组(P<0.01),Aliskiren治疗后大鼠肾组织mTOR表达较糖尿病组显著下调(P<0.01)。 结论肾素抑制剂能减少糖尿病大鼠足细胞排泄,减少尿蛋白,其肾脏保护机制可能与下调肾组织mTOR表达有关。