青春期营养性肥胖对大鼠睾丸发育的影响及机制探讨

背景： 营养性肥胖（又称单纯性肥胖）是一个与生活方式密切相关，过度营养、运动不足和行为异常为特征的全身脂肪组织的过度增生性慢性疾病，而不是由某些先天遗传性疾病或代谢性疾病及神经和内分泌疾病所引起的继发性病理性肥胖。随着人民生活水平的提高，脂类物质摄入量的增加，青少年营养性肥胖症在全世界范围内流行且日趋严重，已经成为世界范围内最受关注的营养性疾病之一。无论是在发达国家还是发展中国家，都呈上升趋势，尤其是城市男童单纯性肥胖的发生趋势增加较为突出。肥胖症不仅极大程度地危害着儿童的健康成长，而且还是成人期肥胖、高血压、心血管疾病和2型糖尿病的重要危险因素。大多数肥胖儿童在成人后都将发展成为肥胖个体，成年期肥胖是老年期死亡的强有力的预测因子。青少年时期正处在睾丸生长发育的关键阶段，此时的营养性肥胖易引起生殖内分泌功能的变化及性腺发育异常，进而影响精子发生，如果处理不当，可能对其成年后的生育功能造成严重的影响。目前在这一领域国内外的研究中，大多数学者主要观察雌性动物或女性在肥胖情况下的生理变化，而关于营养性肥胖对青春期雄性睾丸发育的影响及其机制鲜有报道。因此，我们拟通过以高脂饮食建立动物青春期时营养性肥胖模型，探讨青春期营养性肥胖对睾丸发育的影响以及性激素和瘦素分泌及其受体表达的变化，期望有助于认识营养性肥胖对青春期雄性睾丸发育的影响及其机制，为临床上应尽早采取科学、合理、有效的相应的干预及治疗措施提供了一定的理论依据。 目的： （1）探讨营养性肥胖对青春期雄性大鼠睾丸发育及其性激素分泌功能的影响，分析睾丸生精细胞周期，阐明营养性肥胖对青春期雄性大鼠睾丸生精功能的影响； （2）了解不同时期发育阶段的肥胖大鼠睾丸组织内AR和IGF-IR的分布，同时检测血清瘦素含量，观察营养性肥胖大鼠睾丸组织Ob-R的表达情况，探讨青春期肥胖引起睾丸发育不全的原因。 材料与方法： 21天初断乳雄性大鼠，体重40～60克。随机将大鼠分为普通饲料饲养对照组（n=32）和高脂、高能量饲料实验组（n=48）喂养。对照组饲以普通饲料，实验组用高脂、高能量饲料喂养。所有大鼠实验期间均自由饮水，饲料每日分3次供给，吃完后不再添加。昼夜比12：12，温度18～25℃。分别于高脂、高能量饲料喂养的第3、4、5、6周末（即鼠龄为6、7、8、9周）进行实验。观察喂养后大鼠体重，Lee's指数，体长，附睾周围脂肪重量，睾丸重量、附睾重量的变化；全自动生化分析仪检测外周血甘油三脂（TG）和总胆固醇（TC）；采用组织化学和免疫组织化学方法，分析营养性肥胖对青春期SD大鼠睾丸曲细精管细胞形态结构、雄激素受体蛋白、胰岛素样生长因子-Ⅰ受体蛋白及生精细胞瘦素受体蛋白表达与分布的影响；全自动微粒子化学发光免疫分析系统检测血清睾酮（T）、雌二醇（E2）；利用流式细胞细胞仪检测睾丸生精细胞周期的改变；采用酶联免疫吸附法检测各组大鼠血清内瘦素含量。 结果： 1．肥胖模型的制备：高脂饲养组大鼠体重增长较快，在喂养后第3周末至第6周末高脂饲养组大鼠体重分别高于对照组大鼠（P＜0.01）；第3周末体重已明显超过对照组23％，随着大鼠周龄的增加，肥胖也在逐渐加重，至第6周末时体重进一步超过对照组26.6％。在整个实验所有喂养的大鼠中，普通饲料组肥胖者2只，高脂饲料组肥胖者29只（x2=20.908，P＜0.001），同时高脂饲料组大鼠的致肥率达64.4％。TG随着肥胖程度增加而逐渐增高，至实验末，两组含量有显著性差异（P＜0.01），而对照组随着大鼠周龄增加，甘油三酯含量却逐渐降低。TC含量在第3周末两组没有明显差别，从第4周开始，与对照组相比，实验组含量明显升高（P＜0.05），至第5、6周末，两组含量有显著性差异（P＜0.01）。 2．睾丸组织学观察：对照组大鼠睾丸生精小管发育正常，生精细胞排列紧密，结构清晰，紧贴上皮基膜的精原细胞增殖正常，管腔内已可见精原细胞、初级精母细胞、精子细胞等各个发育阶段的细胞，至实验第6周末，睾丸生精小管发育已完全成熟。实验组部分大鼠睾丸生精小管管壁变薄，成熟精子数量明显减少。偶可见细胞脱落现象，个别动物出现生精细胞与基底膜之间出现脱离、生精细胞成团脱落于管腔中。 3．血清总睾酮（T）、雌二醇（E2）：无论对照组还是实验组，血清中睾酮浓度基本是随大鼠周龄增长而上升，而肥胖大鼠在各个周龄段的睾酮平均水平都显著低于同周龄段对照组。血清E2水平在对照组随着大鼠周龄增长而逐渐降低，实验组中第3、4、5周末也是逐渐降低的，而在第6周末E2水平则呈现增长的趋势，且明显高于对照组（P＜0.01）。 4．睾丸生精细胞周期：与对照组相比，第3周末肥胖组大鼠的G0／G1期细胞显著增多（P＜0.05），S期细胞的百分数在第3、4周末明显降低（P＜0.05）；随着肥胖程度的增加，至第5，6周末，肥胖组大鼠S期细胞的百分数进一步显著下降（P＜0.01），此时处于G2／M期细胞的百分数显著高于对照组（P＜0.05）。从细胞群比例变化顺序改变提示：营养性肥胖引起睾丸精原细胞转化为初级精母细胞逐渐增多，但初级精母细胞却出现转化障碍，进而引起精子细胞及精子数目的减少。 5．雄激素受体（Androgen receptor）蛋白、胰岛素样生长因子-Ⅰ受体（Insulin growth factor-Ⅰreceptor）蛋白表达与分布情况： 免疫组化结果显示睾丸Leydig细胞，Sertoli细胞，生精小管内肌样细胞，血管壁平滑肌细胞及内皮细胞均有AR表达，而生精细胞内未发现AR表达。正常饲料喂养大鼠3周后睾丸AR表达强度最强，并达到峰值；此后AR表达逐渐减弱。与对照组相比实验组大鼠高脂高能饲养3周起，AR阳性表达有逐渐减少趋势，随着肥胖程度的增加，AR阳性表达减弱逐渐明显，至6周后，肥胖组大鼠睾丸AR表达显著低于对照组（P＜0.01）。 胰岛素样生长因子-Ⅰ受体：正常饲料喂养大鼠3周末开始睾丸IGF-IR表达逐渐增强，至第6周时达到峰值。实验大鼠组在喂养后3周末开始IGF-IR阳性表达逐渐减弱，并低于对照组（P＜0.01），至第6周时，IGF-IR阳性主要表达于精原细胞，此时两组间蛋白的表达差异具有显著（P＜0.01）。 6．瘦素含量及瘦素受体蛋白（Ob-R）表达与分布情况在饮食诱导肥胖大鼠血浆中Leptin水平明显升高，第4周始肥胖组大鼠血Leptin水平显著高与对照组（P＜0.01）。实验组大鼠睾丸Ob-R表达含量逐渐降低。第六周末显著低于对照组（P＜0.01）；Ob-R表达阳性计数发现Ob-R表达阳性细胞率也显著低于对照组（P＜0.01）。结果提示营养性肥胖大鼠存在着瘦素抵抗现象。 结论： 1．青春期营养性肥胖可造成睾丸组织显微结构和性激素分泌异常； 2．营养性肥胖可以使青春期大鼠睾丸精原细胞转化为初级精母细胞增多，但初级精母细胞却出现了转化障碍，使精子细胞和精子数目减少； 3．营养性肥胖对青春期大鼠睾丸发育的影响可能与血浆睾酮下降、睾丸AR表达减弱、Ob-R蛋白表达减少和IGF-IR阳性表达减弱有关。