灵芝硒多糖SeGLP-2B-1诱导乳腺癌细胞MCF-7凋亡机制的研究

硒多糖作为一种有机硒化合物,兼有多糖与硒的活性,其生物活性普遍高于多糖和硒,更易于为机体吸收和利用。本实验通过生物转化的方法把无机硒加入到灵芝菌丝体中,将灵芝多糖和硒有机结合成为灵芝硒多糖,使硒和多糖的生理及药理功能得到优化。灵芝硒多糖具有多种生理活性,它可拮抗重金属中毒和抗活性氧损伤,从而发挥其抗氧化作用;影响细胞周期,使肿瘤细胞DNA合成受阻而抑制肿瘤细胞生长;并能够通过氧化应激、ROS介导、调控癌基因和抑癌基因的表达、调节细胞周期相关蛋白、激活caspase系列酶等途径诱导肿瘤细胞凋亡等。 本实验通过灵芝深层发酵,有效的将无机硒转化成有机硒并富集于灵芝菌丝体中,并从中分离纯化得到灵芝硒多糖SeGLP-2B-1。SeGLP-2B-1可以诱导肿瘤细胞MCF-7凋亡。将其作用于MCF-7细胞24h、48h、72h后,用MTT法检测抑制率,结果显示SeGLP-2B-1作用MCF-7 24h后,细胞开始出现凋亡,凋亡率达到25.39%。延长作用至72小时,最高的抑制率可达到80.53%,IC50值达0.158μM;利用琼脂糖凝胶电泳观察DNA的变化发现,药物作用24h后,MCF-7细胞DNA电泳开始有少量降解,72h后可明显看到DNA被降解的现象;用PI染色法通过流式细胞仪检测SeGLP-2B-1对MCF-7细胞周期的影响,SeGLP-2B-1作用24h后可看见明显的AP峰,说明MCF-7细胞已经开始凋亡。以上实验结果说明SeGLP-2B-1对MCF-7细胞有明显的抑制作用,可以诱导MCF-7细胞出现凋亡。 本实验初步探讨了SeGLP-2B-1诱导肿瘤细胞MCF-7凋亡的分子机制。运用Rhodamine123荧光染色,通过流式细胞仪检测细胞内线粒体的膜电位,SeGLP-2B-1作用24h后MCF-7细胞线粒体膜电位开始下降,延长至72h后线粒体膜电位下降一倍以上,证明此时MCF-7细胞线粒体膜的完整性已经被破坏,线粒体跨膜位点(ΔΨm)崩溃。而细胞质中细胞色素C含量的增加,又进一步证明了线粒体膜通透性转运孔开放,导致线粒体中细胞色素C释放到细胞质中。细胞色素C能诱导细胞凋亡信号中caspase系列蛋白的激活,即级联瀑布效应。本研究通过western blot证明SeGLP-2B-1作用MCF-7细胞48h后,caspase-9和caspase-3已被激活,PARP发生裂解,产生83kD的分子。caspase-9是线粒体途径的关键酶,可以激活凋亡效应信号蛋白caspase-3,从而引发凋亡的发生。本研究发现SeGLP-2B-1作用48h后,caspase-8也可以被激活。caspase-8是细胞凋亡中死亡受体途径的信号蛋白,说明SeGLP-2B-1可能同时通过两条途径诱导MCF-7细胞凋亡。 0.09μMSeGLP-2B-1作用细胞24h、48h、72h后,细胞内ROS的水平降低,降低量呈时效关系。说明低浓度的灵芝硒多糖SeGLP-2B-1可以通过提高谷胱甘肽过氧化物酶GPx的活性,降低肿瘤细胞内活性氧水平来提高细胞内的抗氧化性。