川芎嗪二苯甲基哌嗪对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用研究

血管内皮细胞功能障碍是多种心脑血管疾病发病的共同环节，它触发和促进动脉粥样硬化、高血压、心肌梗塞等。多种因素，如急性缺血、中毒、氧化应激、同型半胱氨酸血症等都可引起血管内皮细胞肿胀、脱落、调亡、坏死等损伤。 川芎嗪是中药川芎的主要有效成分之一，具有清除氧自由基、钙拮抗、扩血管、抗血小板聚集和血栓形成等多种作用，广泛应用于临床治疗。但川芎嗪分子中的甲基易被氧化，生成极性和水溶性较大的代谢物而迅速被排出体外，所以川芎嗪存在半衰期短，生物利用度低等缺点。经川芎嗪及其衍生物构效关系研究，证实吡嗪环为其基本药效基团；2，3，5，6位甲基为药代基团。在保留川芎嗪母核（吡嗪环）基本药效基团不变的基础上，以氟桂利嗪的（4，4’—二氟）二苯甲基—1—哌嗪基甲基基团取代川芎嗪的2位甲基，合成出川芎嗪二苯甲基哌嗪。氟桂利嗪是临床上重要的心脑血管疾病治疗药物，（4，4’—二氟）二苯甲基哌嗪是其重要的活性基团。以氟桂利嗪的活性基团取代川芎嗪分子的药代基团，以期克服川芎嗪体内半衰期短、生物利用度低等缺点，并通过协同作用增强药效，提高抗心脑血管疾病作用。 本实验采用过氧化氢作为外源性自由基生成系统，模拟血管内皮细胞的脂质过氧化损伤，建立离体培养的血管内皮细胞（ECV-304）氧化应激损伤模型，观察川芎嗪二苯甲基哌嗪对氧化损伤血管内皮细胞的保护作用及探讨其可能的机制，为其用于心、脑血管疾病治疗提供进一步的资料，同时也为传统中药的开发提供新思路。 1．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞活性的影响 采用MTT法测定细胞活性。实验结果显示，ECV-304细胞氧化损伤后，细胞活力显著降低（P＜0.01）。而10、50、100μmol／L川芎嗪二苯甲基哌嗪可增强氧化损伤ECV-304细胞活力（P＜0.01）。 2．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞培养液LDH释放率的影响 收集氧化损伤处理后的ECV-304细胞培养上清液和细胞裂解液，参照试剂盒说明分别测定培养上清液和细胞裂解液中的LDH活性，计算细胞LDH释放率。实验结果表明，ECV-304细胞经H2O2损伤后，细胞活力降低，细胞膜通透性增加，胞内LDH漏出增多，培养液中LDH水平显著升高（P＜0.01）。而50、100μmol／L川芎嗪二苯甲基哌嗪处理后的细胞，细胞活力升高，LDH释放率明显减低（P＜0.05）。 3．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞培养液中MDA含量、SOD活力和GSH-Px活力的影响 收集氧化损伤处理后的ECV-304细胞培养上清液。参照MDA、SOD、GSH-Px检测试剂盒说明分别测定细胞MDA含量、SOD活力、GSH-Px活力。实验结果表明，氧化损伤后培养液中MDA含量显著增加（P＜0.01），SOD活力与GSH-Px活力显著降低（P＜0.01）。经100μmol／L川芎嗪二苯甲基哌嗪处理后，细胞MDA含量显著减少（P＜0.01）；SOD活力和GSH-Px活力均显著升高（P＜0.01）。 4．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞ROS的影响 细胞经处理后制备细胞悬液，以DCFH-DA负载细胞。将细胞悬液分成六组：正常组、模型组及各浓度药物作用组，依次加到96孔板中，置多功能酶标仪检测荧光值(λex=488nm，λem=525nm)。按公式计算ROS。实验结果表明，H2O2氧化损伤后胞内ROS浓度显著升高（P＜0.01），而10、50、100μmol／L川芎嗪二苯甲基哌嗪能明显降低氧化受损细胞内的ROS浓度（P＜0.05）。 5．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞染色质的影响 细胞经处理后，以多聚甲醛室温固定，Hoechst 33258染色于荧光显微镜下观察并拍照。实验结果表明，细胞经Hoechst 33258染色后，正常组细胞核较大且染色均匀；模型组细胞核内可见致密的颗粒状荧光，呈现出凋亡细胞典型的核固缩、核碎裂表现；川芎嗪二苯甲基哌嗪各浓度组细胞的胞核形态趋于正常，且凋亡细胞数随剂量增加而减少。 6．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞凋亡率的影响 细胞经处理后，以Annexin V-FITC／PI双染后上流式细胞仪检测。实验结果表明，与正常组比较，模型组细胞的凋亡率明显升高。与模型组比较，川芎嗪二苯甲基哌嗪各浓度组细胞的凋亡率降低，且呈剂量依赖性关系。 7．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞胞内钙离子浓度的影响 制备细胞悬液，以Fura-2／AM负载。将细胞悬液分成六组：正常组、模型组及各浓度药物作用组依次加到96孔板中，置多功能酶标仪检测λex=340 nm／λem=510 nm和λex=380 nm／λem=510 nm处荧光比值。按公式计算[Ca2+]i。实验结果表明，ECV-304细胞氧化损伤后胞内游离钙离子浓度显著升高（P＜0.01），而50、100 gmol／L川芎嗪二苯甲基哌嗪能显著抑制胞内钙浓度（P＜0.01）。 8．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞线粒体膜电位的影响 细胞经处理后，经Rh123染色后上流式细胞仪检测。实验结果表明，与正常组比较，模型组细胞线粒体膜电位明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，川芎嗪二苯甲基哌嗪组细胞线粒体膜电位显著升高，且呈剂量依赖性关系（P＜0.01）。 9．川芎嗪二苯甲基哌嗪对H2O2氧化损伤ECV-304细胞胞内Bcl-2蛋白，P-53蛋白，Caspase-3蛋白表达的影响 细胞经处理后，经细胞爬片、冲洗和固定，按免疫组织化学方法染色检测Bcl-2蛋白，P-53蛋白和Caspase-3蛋白表达。实验结果表明，模型组细胞Bcl-2蛋白表达明显减少（P＜0.01），而P-53蛋白和Caspase-3蛋白表达增加（P＜0.01）。经川芎嗪二苯甲基哌嗪50、100μmol／L处理后，细胞的Bcl-2蛋白表达明显增加（P＜0.05），P-53蛋白和Caspase-3蛋白表达则减少（P＜0.05）。