小鼠胚胎干细胞建系新方法及TFAG促进鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的初步研究

目的 利用小鼠胚胎着床初期1～3天子宫组织块培养分离内细胞团，探讨获得胚胎干细胞的可能性及白蒺藜醇甙（TFAG）对小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的影响。 方法 分离小鼠胚胎着床初期1～3天（孕4.5～6.5天）小鼠子宫，剪碎后进行组织块培养，2天内分离内细胞团，以后按常规的胚胎干细胞培养及传代方法进行传代。分化诱导实验是将小鼠胚胎干细胞在无白血病生长抑制因子（LIF）及无MEF饲养层条件下形成类胚体（EB），将EB打散成单细胞，分组添加维甲酸（RA）及TFAG，种植于粘附性的组织培养皿中，诱导分化4天，进行细胞形态观察及苔盼蓝活细胞计数；再在无RA及TFAG的条件下培养2天后用抗小鼠NF200及GFAP抗体进行免疫组化鉴定。 结果 用这种方法已建立一株小鼠胚胎干细胞系，传至第10代，AKP染色强阳性，RT-PCR证实Oct-4表达强阳性。分化诱导实验中，各组均加相同浓度RA，其浓度为5×10-7mol/L，不加TFAG的对照组活细胞计数为5.5×10～4/ml，转化的细胞40％为神经元细胞，10％为神经胶质细胞；与对照组比较，实验组TFAG在浓度分别为5×10-3g/L、5×10-4g/L、5×10-5g/L、5×10-6g/L时，活细胞计数分别为对照组的11.9、6.2、2.8、1.2倍，转化的神经元细胞所占比例分别为对照组的1.9、1.6、1.4、1.1倍，转化的神经胶质细胞所占比例无变化。 结论 1．小鼠胚胎着床初期1～3天子宫组织块培养可以分离出未分化的内细胞团，获得胚胎干细胞；与传统方法相比，这种新方法极大简化了实验步骤，降低了实验技术难度。2．TFAG可明显加快转化的神经细胞生长，高浓度时可诱导EB细胞向神经元细胞转化。