黄芪糖蛋白对CIA模型小鼠Th17/Treg细胞平衡的影响及机制研究

目的类风湿关节炎是(rheumatoid arthritis,RA)—种以多关节滑膜炎,骨及软骨破坏为主要特征的慢性自身免疫性疾病,病变早期主要表现为关节的肿胀疼痛、晨僵及功能障碍,晚期可出现不同程度的关节畸形,致残率很高。黄芪糖蛋白(Astragalus membranaceus glycoprotein,AmGP),是本课题组通过水浸提法自膜荚黄芪的干燥根中分离出的一种糖蛋白的均一组分,后期进而从AmGP中分离纯化出一种16kD的天然糖蛋白活性分子,命名为AmRP10-16。Th17细胞与Treg细胞是CD4+T细胞的两个亚型,Th17/Treg细胞平衡对维持机体的免疫稳态具有重要作用。最新研究证明,Th17/Treg细胞失衡是RA发病的关键环节。课题组前期研究发现,AmGP在体外具有一定的免疫抑制作用,体内用药可改善佐剂性关节炎(adjuvant arthritis,AA)大鼠与胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠的关节炎症,但自AmGP中新分离纯化出的AmRP10-16(下文统称为AmGP)的免疫活性及其对CIA小鼠的疗效及作用机制尚待研究。本课题体外实验通过常规分离小鼠脾淋巴细胞,采用MTT法检测AmGP对小鼠脾T、B淋巴细胞增殖的影响,探究AmGP的体外免疫活性;体内实验通过建立CIA小鼠模型,予AmGP腹腔注射给药,以Th17/Treg细胞平衡为切入点探究AmGP作用于CIA小鼠的疗效及可能机制,为中药黄芪临床治疗RA提供实验基础。方法1.MTT法检测AmGP对小鼠脾脏T、B淋巴细胞体外增殖的影响。2.建立CIA小鼠模型,将CIA小鼠随机分为模型组、氢化可的松(Hydrocortisone,HC)阳性对照组、AmGP低、中、高剂量组,每组10只;基础免疫后第42天开始腹腔注射治疗,给药剂量分别为:HC组为10mg/kg;AmGP低、中、高剂量组分别为0.5mg/kg、1.0mg/kg、2.0mg/kg;正常组、模型组小鼠为等体积生理盐水;注射体积均为0.4ml/20g,每天一次。治疗两周后,通过观察各组小鼠的一般情况、关节炎指数评分、膝关节组织病理变化等指标评定CIA小鼠病情严重程度。3.流式细胞术检测小鼠外周血Th17、Treg细胞比例。4.Western blot 法检测小鼠脾组织 RORyt、Foxp3、P-STAT3、P-STAT5 蛋白的表达。5.免疫组织化学法检测小鼠脾组织RORyt、Foxp3、P-STAT3、P-STAT5蛋白的阳性表达。结果1.AmGP的体外免疫活性AmGP于体外显著抑制了小鼠脾T、B淋巴细胞的增殖(P<0.01),不同剂量AmGP对ConA、LPS刺激下的小鼠脾T、B淋巴细胞的体外增殖均具有抑制活性。2.胶原诱导性关节炎小鼠模型的制备及形态学观察AmGP不仅改善了 CIA小鼠的饮食及精神状态,增加其活动度,降低CIA小鼠的关节炎指数评分,而且能够改善CIA小鼠关节滑膜的病理状态,减轻其关节软骨及骨破坏程度,表明AmGP可改善CIA模型小鼠的关炎症。3.AmGP对CIA小鼠Th17/Treg细胞平衡的影响及其机制(1)流式结果表明,与正常组比较,模型组小鼠外周血中Th17细胞比例升高,Treg细胞比例降低(P<0.01)。与模型组比较,HC组及AmGP各剂量组Th17细胞比例降低,Treg细胞比例升高,且差异有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。(2)Western blot与免疫组织化学结果显示,与正常组比较,模型组小鼠脾组织中RORyt、P-STAT3蛋白表达量升高,Foxp3、P-STAT5蛋白表达量降低(P<0.01);与模型组比较,HC组和AmGP各剂量组小鼠脾组织RORyt、P-STAT3蛋白表达量呈现下调趋势(P<0.05,P<0.01),而 Foxp3、P-STAT5 的蛋白表达则显著上调(P<0.05,P<0.01)。结论1.AmGP对小鼠脾T、B淋巴细胞的体外增殖具免疫抑制活性。2.AmGP可降低CIA小鼠的关节炎指数,减轻CIA小鼠血管翳生成、关节软骨及骨破坏程度,表明AmGP可在一定程度上改善CIA小鼠关节炎症,抑制病情发展。3.AmGP可降低CIA小鼠外周血Th17细胞及其脾组织转录因子RORyt、P-STAT3水平,同时上调Treg细胞及其转录因子Foxp3、P-STAT5水平,表明AmGP可能通过有效抑制JAK-STAT3信号通路激活,降低RORyt表达,同时诱导JAK-STAT5信号通路活化,上调Foxp3表达,从而有效纠正Th17/Treg细胞平衡,来实现对CIA小鼠的治疗作用。