青钱柳多糖的分离纯化与结构解析及其生物活性研究

青钱柳[Cyclocarya paliurus（Batal.）Iljinskaja]又名摇钱树，系胡桃科（Juglaruiaceae）青钱柳属植物。它是我国特有的单种属植物，广泛分布于安徽、福建、湖北、湖南、江苏、江西、四川、贵州、浙江等地的海拔420～2500 m的山区，是国家重点保护的濒危植物之一。其树皮、树叶可用于治疗糖尿病、高血压、高血脂。目前，青钱柳茶已得到美国食品与药品管理局（FDA）的认可，是我国第一个获得美国FDA颁发质量证书的保健茶。本文以江西修水的青钱柳为实验材料，综合应用食品科学、有机化学、天然产物化学、分析化学、生物技术及现代仪器分析等一系列现代研究方法和技术手段，较为系统地研究了从青钱柳中提取纯化出来的青钱柳多糖。对该多糖的含量测定、提取纯化、分子量、单糖组成、结构特点及部分生物活性进行了较深入的研究。本文对青钱柳多糖的提取、测定及生物学活性作用进行了较深入的研究，为青钱柳多糖作为功能性食品基料和用于新药开发的研究奠定了基础。主要研究内容与结论概括如下： 1．将蒽酮-硫酸法用于测定青钱柳多糖的含量。青钱柳用水提取，经多级处理除去脂类、单糖、双糖、低聚糖、氨基酸、蛋白质等杂质制得青钱柳精制多糖，精制多糖溶解后与蒽酮-硫酸试剂显色，通过扫描确定最大吸收波长，然后用精制多糖测得青钱柳多糖对葡萄糖的换算因子。结果表明，该测定方法简便可行，供试液在8 h内显色稳定，重现性较好，平均回收率为100.8％（RSD=1.90％，n=3）。所测江西修水青钱柳中多糖含量为4.387％。 2．将两种植物活性成分提取技术应用于青钱柳多糖的提取研究。以江西修水青钱柳粉末为原料，采用热水浸提法提取青钱柳多糖。研究了提取温度、提取次数、提取时间和料液比对青钱柳多糖得率的影响，并以提取次数、提取时间和料液比为考察因素，在90℃下，采用L9（3～3）正交实验确定了热水浸提法提取青钱柳多糖的最佳工艺参数，即提取次数为3次，提取时间为150 min，液料比为1：8。在上述提取条件下，热水浸提法提取青钱柳多糖得率可达到6.54％。在单因素实验的基础上，利用Box-Benhnken中心组合实验和响应面分析法，确定了超声辅助提取青钱柳多糖工艺的最佳条件，即固液比为1：8，温度为58℃，时间为59 min，在此条件下青钱柳多糖理论提取值达到4.96％。 3．探讨了青钱柳多糖的脱色工艺。青钱柳粗多糖色泽很深，呈黑褐色，影响其分离纯化、化学结构、作用机理及构效关系的研究。本文研究了活性炭吸附法用于青钱柳粗多糖液脱色的的效果，探索活性炭吸附法用于青钱柳多糖脱色的可行性。分别以粗多糖液脱色率为指标，采用正交试验法对脱色的最佳工艺进行优选并考察活性炭吸附法对青钱柳粗多糖的影响。结果表明，活性炭吸附法对青钱柳粗多糖液具有良好的脱色效果，脱色的最佳工艺条件为：温度为40℃，吸附时间20 min，活性炭用量1.0％，pH值3.5。结论：活性炭吸附法用于青钱柳多糖的脱色效果良好，且简便易行。 4．研究了青钱柳多糖的纯化工艺及理化性质。本文首次运用Sephacryl-400葡聚糖凝胶层析柱与大分子纯化系统（?）KTA Purifier 100联用对青钱柳精制多糖进行纯化，得到一个主要多糖组分，该组分在示差检测器上监视的多糖吸收峰和紫外检测到的蛋白质特征吸收峰的最大值位置基本重叠，表明该组分可能是糖和蛋白的复合物，收集该组分，命名为CPC-1。将纯化所得青钱柳多糖CPC-1，经HPGPC法检测为均匀对称单一色谱峰，以已知分子量的T-10、T-40、T-70、T-500标准葡聚糖和蓝色葡聚糖为标准作出标准曲线，采用HPGPC法测定了CPC-1的分子量，大小分别为1105859道尔顿。通过氨基酸自动分析仪法测定CPC-1中氨基酸种类及含量表明CPC-1中含有17种氨基酸成分，其中天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸和精氨酸含量较高。通过GC以及GC-MS测定分析，CPC-1为一杂多糖，它由六种单糖组成，分别是鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，通过GC测定分析其摩尔比为10.64：31.23：3.23：8.72：30.16：16.02；其中，阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖的含量较高，木糖含量最低。红外光谱分析结果表明其具有典型的多糖特征吸收峰。 5．研究了青钱柳多糖的生物活性，包括体外抗氧化实验、抑制α-淀粉酶活力以及抑菌实验。青钱柳多糖对OH·自由基、O2·清除效果相对较低，但对二苯代苦味酰自由基（DPPH）有显著清除作用，同时通过硫代巴比妥酸（TBA）法测得其对亚油酸具有抗氧化作用。青钱柳多糖对α-淀粉酶活力具有一定的抑制作用，当青钱柳多糖浓度为1.0 mg／mL时，抑制率达13％。青钱柳多糖对α-淀粉酶活力的抑制作用均随多糖浓度的增大而增加，这表明青钱柳的降血糖作用与青钱柳多糖的含量有关。用滤纸片抑菌圈实验法研究了青钱柳多糖对常见的几种菌的抑制作用。结果表明：青钱柳对酵母菌有明显抑制作用，对假丝酵母的抑制作用尤其强烈。多糖对细菌有明显的抑制作用，对黑曲霉、青霉和毛霉三种霉菌无抑制作用。