艾灸对膝骨性关节炎的防治作用及其机理的实验研究

目的 艾灸作为中医的外治法之一,具有操作简便,无痛苦、疗效明显的优点,在临床上治疗膝关节骨性关节炎(osteoarthritis,OA)有较好的疗效,是极具特色的中医治未病疗法之一。但是艾灸治疗膝0A的作用机理仍不十分明确,尤其是对0A的预防作用研究尚未见报道。 因此,本课题在现代科学的方法论指导下,利用现代医学先进的实验技术方法,采用膝关节改良伸直位固定法建立兔膝0A模型,运用艾灸对正在进行造模的兔施以温和灸治,在造模8周后,对软骨标本行组织形态学观察,检测关节液中白细胞介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子·-α(TNF-α)的含量,测定软骨细胞凋亡率,观察软骨细胞Bc1-2、Bax和P53蛋白表达,检测关节软骨中Bc 1-2和Fas的mRNA表达,从组织、细胞、分子等不同层面,探讨艾灸对兔膝0A的防治作用和机理,为临床艾灸防治0A提供实验依据。 方法 40只日本大耳白兔,随机分成4组，每组10只：艾灸组(A组)、几丁糖组(B组)、模型组(C组)和正常组(D组)。A、B、C组均用改良伸直位固定法建立膝0A模型,A、B组在造模后立即进行干预,‘A组选取关元、足三里、血海、内外膝眼、阳陵泉等腧穴,用艾条温和灸治，每天1次,每次每穴10min；B组用医用几丁糖(20mg/ml)予以膝关节注射,0.2ml/次,每周1次；C组不做治疗,D组正常饲养，不做任何处理。造模8周后,各组分别从影像学、肉眼、光镜下、透射电镜(TEM)下观察兔膝关节组织形态学情况,并用Mankin评分比较各组膝关节软骨的组织形态学改变；用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测各组关节液中IL-1β和TNF-α的含量；TdT介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法(TUNEL)检测各组软骨细胞凋亡指数(AI)；免疫组织化学法(I HC)观察Bc 1-2、Bax、P53蛋白表达情况；荧光实时定量PCR法(Real-Time PCR)检测各组关节软骨中Bc1-2和Fas的mRNA表达情况。 结果 1.X片观察：A、B组关节间隙正常,未见骨赘生成,C组可见膝关节间隙狭窄,局部有骨赘形成；大体肉眼观察：A、B组关节软骨表面光滑,无软骨缺损,C组关节囊明显增厚,关节软骨呈灰黄色,局部出现溃疡；光镜观察：A组软骨表面光滑,深层细胞排列规律,番红0染色轻度减弱,潮线完整,C组软骨产生裂隙,深达辐射区,深层细胞数目异常,番红0染色中、重度减弱,潮线模糊；Mankin评分：A、B组评分均明显较C组低(P<0.01),A组评分稍低于B组(P>0.05)；电镜观察：A组软骨细胞超微结构接近D组,C组软骨细胞轮廓不清楚,胞膜坏死崩解,胞浆内细胞器消失,细胞裂解为致密颗粒样物质,细胞固缩、变形,甚至出现核分裂,染色质浓聚。 2.A、B组IL-1β和TNF-α含量均明显低于C组(P<0.01)；A组IL-1β含量和TNF-α含量比B组稍低(P>0.05)。 3.A、B组凋亡阳性细胞较少,散在分布于关节软骨浅表区,C组凋亡阳性细胞较多,出现在关节软骨中深层。A、B组凋亡指数明显低于C组(P<0.01)；A组凋亡指数较B组低(P<0.05)。 4.Bc 1-2表达阳性细胞率：A、B组高于C组(P<0.05),A组稍高于B组(P>0.05)；Bax表达阳性细胞率：A、B组明显低于C组(P<0.05),A组低于B组(P<0.05)；Bc1-2/Bax：A组高于B、C、D组(P<0.05)。 P53表达阳性细胞率：A、B组明显低于C组(P<0.01),A组比B组稍低(P>0.05)。 5.Bcl-2 mRNA的相对表达量：A、B、C组分别为D组的1.38±0.96倍、1.27±1.15倍、1.08±0.89倍,A、B组和C组Bc卜2的mRNA表达差别均有非常显著意义(P<0.01),A组和B组差别无显著意义(P>0.05)；Fas mRNA的相对表达量,A、B、C组分别为D组的0.27±0.07倍、0.31±1.13倍、2.32±1.35倍,A、B组和C组Fa s的mRNA表达差别均有非常显著意义(P<0.01),A组和B组差别无显著意义(P>0.05)。 结论 1.用改良伸直位固定法造模8周,可成功建立兔膝0A模型。 2.艾灸关元、血海、内外膝眼、足三里和阳陵泉等腧穴,能防治兔膝0A。 3.艾灸可降低关节液中IL-1β和TNF-α含量,上调Bcl-2 mRNA表达,下调Fas mRNA表达,促进Bc 1-2蛋白表达,抑制Bax和P53蛋白表达,防止软骨基质降解和抑制软骨细胞过度凋亡,从而达到防治兔膝0A的效果。 4.几丁糖可保护关节软骨防治兔膝0A。