中药山茱萸（Fructus corni）为山茱萸科植物山茱萸（Cornus officinalis Sieb. et Zucc.）的干燥成熟果肉,为我国传统名贵中药,有补肝肾,涩精气,固虚脱之功效。现代药理研究表明,山茱萸具有免疫调节、降低血糖、抗休克、抗心律失常、抗菌和抗炎等活性。其主要药效成分马钱苷（loganin）和莫诺苷（morroniside）同属环烯醚萜苷类,马钱苷具有调节免疫、抗炎和抗休克作用,莫诺苷具有苦补健胃和预防糖尿病性血管病的作用。
中药药物代谢动力学（ Pharmacokinetics of traditional Chinese medicine,PTCM）借助动力学原理,研究中药有效成分、有效部位、中药单方与复方制剂在体内吸收、分布、代谢和排泄等一系列过程的动态变化规律及其体内时量?时效关系,是中药现代化研究的重要内容之一,可以使传统天然药物化学研究与药理药效研究有机地结合起来,对阐明中药的有效性、探求中药的药效物质基础和作用机制等都具有重要意义;而中药成分代谢化学为活性成分的发现及新的前体药物的制备提供理论和实践依据。
本论文建立了山茱萸提取液指纹图谱以控制其质量,并考察了其中可吸收入血的化学成分,以此为依据对山茱萸进行了提取分离,制备了马钱苷和莫诺苷两种单体成分,探讨了马钱苷和莫诺苷在大鼠体内吸收、组织分布、代谢及排泄特点,研究了马钱苷和莫诺苷的作用机制,为中药化学成分的药物代谢动力学及中药药效物质基础研究做出了有意义的探索。
第一部分山茱萸提取液指纹图谱及其不同有效部位的血清指纹图谱
目的:建立山茱萸提取液的HPLC指纹图谱分析方法,并比较其不同有效部位的指纹图谱;考察大鼠给予山茱萸提取液不同有效部位后所得血清指纹图谱。
方法:山茱萸提取液HPLC指纹图谱研究,色谱柱为C18柱,流动相为乙腈-0.15%磷酸水溶液梯度洗脱,检测波长217 nm,流速1.0 mL·min-1,柱温30℃。山茱萸提取液及其经乙酸乙酯萃取、正丁醇萃取和剩余液4个有效部位分别在以上条件下分析,同时灌胃给予大鼠4个有效部位后,取血清分析。
结果:建立了山茱萸提取液指纹图谱,10批山茱萸提取液指纹图谱相似度在0.934～0.995之间;山茱萸提取液中主要成分为马钱苷、莫诺苷、没食子酸及未知成分X,乙酸乙酯萃取有效部位中成分较单一,主要为没食子酸和X,正丁醇萃取有效部位中为苷类成分,主要为莫诺苷、马钱苷和X,剩余液中成分复杂,含莫诺苷和马钱苷,且含量较低。其中马钱苷、莫诺苷和未知成分X可吸收入血,而在血清中未检测到没食子酸。
结论:该方法精密度高,重现性好,为山茱萸制剂的质量控制提供依据;初步确定了山茱萸提取液体内吸收的部分化学成分,有助于阐明其药效物质基础。
第二部分山茱萸化学成分研究（马钱苷和莫诺苷对照品的制备）
目的:研究从山茱萸中分离制备马钱苷和莫诺苷的方法。
方法:结合大孔树脂富集、硅胶柱层析、制备HPLC等方法对山茱萸水提醇沉提取物进行分离纯化,通过UV、1H-NMR、13C-NMR、MS等波谱学方法对其分离产物进行结构鉴定。
结果:提取分离得到3个化合物,分别鉴定为马钱苷、莫诺苷和獐牙菜苷。所得马钱苷和莫诺苷用归一化法定量,纯度均大于98%。
结论:本法简便,制备成本低,马钱苷和莫诺苷可作为定性定量分析使用的对照品,同时用于药物代谢动力学的研究。
第三部分马钱苷在大鼠体内的吸收、分布和排泄研究
目的:1.建立大鼠血浆中马钱苷浓度的测定方法,研究并比较了单次口服给予马钱苷单体和山茱萸提取液后马钱苷在大鼠体内的药物动力学过程,考察了马钱苷单体口服后的绝对生物利用度;2.建立大鼠组织中马钱苷的测定方法,并研究其组织分布;3.考察马钱苷在大鼠体内的排泄特点。
方法:1.大鼠以20 mg·kg-1灌胃给予马钱苷溶液,分别于给药后5,10,15,30,45,60,90,120,180,240和360 min眼眶静脉取血,置于肝素化塑料离心管中,样品预处理采用甲醇沉淀蛋白,利用HPLC法,色谱柱为反相C18柱（250 mm×4.6 mm,5μm）,流动相为甲醇-水（32 : 68）,流速为1 mL·min-1,检测波长236 nm;2.取大鼠随机分为5组,灌胃给予20 mg·kg-1马钱苷后,于15,45,90,180和360 min分别放血处死,取心、肝、肺、脾、肾、脑、胃和肠,经生理盐水冲洗,去除少量的淤血或组织内容物,并用滤纸吸去水分,称重后于匀浆器中制成600 mg·mL-1的生理盐水匀浆,采用甲醇沉淀蛋白的方法,利用HPLC法,流动相为乙腈-水（16 : 84）,流速为1 mL·min-1,检测波长236 nm,柱温为30℃,测定组织中的马钱苷含量;3.采用沉淀蛋白及固相萃取法进行前处理,利用HPLC法研究马钱苷在尿液、粪便和胆汁中的排泄过程。
结果:1.马钱苷的线性范围15.25～7625 ng·mL-1,日内与日间RSD < 15%,回收率93.5%109.3%。大鼠单次灌胃给予单体马钱苷和山茱萸提取液后,主要药动学参数分别如下:Cmax为2168.6±455.1和1070.6±215.3 ng·mL-1,Tmax为69.0±20.1和51.0±8.2,T1/2为93.6±36.7和99.4±24.6 min,Ke为0.0085±0.0036和0.0073±0.0018 min-1,AUC0-t为291426.3±75866.8和114926.2±32510.7 ng·min·mL-1 , AUC0-∞为323642.4±83113.7和125842.9±36230.6 ng·min·mL -1。灌胃给药后马钱苷单体绝对生物利用度为13.2%;山茱萸提取液中马钱苷相对马钱苷单体口服给药的生物利用度为19.4%;2.大鼠灌胃给予马钱苷20 mg·kg-1后,肾中药物浓度最高,其次在胃、肺、小肠等组织,脑组织中最少。大多数组织的药物含量于给药后90 min最高,然后逐渐下降。3.胆汁中含微量的马钱苷原型药物,粪便中未见马钱苷原型药物;尿液排泄药动学试验表明,24 h内马钱苷原型药物经尿排泄完全,排泄量主要集中在0～4 h,约占总排泄量的81.5%,但排泄总量仅为给药量的5%左右。
结论:1.本法灵敏度高,操作方便,适合于马钱苷的药动学研究;马钱苷单体口服生物利用度较低;2.马钱苷主要分布在肾组织,难以通过血脑屏障进入脑组织。在所研究的组织中,未见明显的蓄积现象;3.马钱苷原型药物主要经尿液排泄。
第四部分莫诺苷在大鼠体内的吸收、分布和排泄研究
目的:1.建立高效液相色谱法（HPLC）测定大鼠血浆中莫诺苷浓度的方法,并研究单次给药后不同剂量莫诺苷单体在大鼠体内的药物动力学过程。2.研究莫诺苷在大鼠体内的组织分布。3.考察莫诺苷在大鼠体内的排泄特点。
方法:1.大鼠以20 mg·kg-1灌胃给予莫诺苷溶液,分别于给药后5,10,15,30,45,60,90,120,180,240和300 min眼眶静脉取血,置于肝素化塑料离心管中,血浆样品采用甲醇沉淀蛋白的方法;色谱柱为C18柱,流动相为甲醇-乙腈-0.1%甲酸（10 : 10 : 80）,流速为1 mL·min-1,检测波长239 nm。2.取大鼠随机分为5组,灌胃莫诺苷(20 mg·kg-1)后,于15,30,60,120和300 min分别放血处死,取心、肝、肺、脾、肾、脑、胃和肠,经生理盐水冲洗,去除少量的淤血或组织内容物,并用滤纸吸去水分,称重后于匀浆器中制成600 mg·mL-1的生理盐水匀浆,采用甲醇沉淀蛋白的方法,HPLC法分析前以甲醇沉淀蛋白,色谱条件同方法1。3.采用沉淀蛋白及固相萃取法进行前处理,利用HPLC法研究莫诺苷在尿液、粪便和胆汁中的排泄特点。
结果:1.莫诺苷的线性范围0.0404～10.1μg·mL-1,最低定量限为0.0404μg·mL-1,RE为–2.62%,RSD为3.2%（n=6）,0.101, 1.01和8.08μg·mL-1三个浓度的日内、日间精密度分别为10.8～2.2%和1.2～4.3%,准确度为0.08～1.22%,回收率99.9%101.8%,RSD为10.9%3.3%,稳定性研究表明样品稳定。大鼠单次按三个不同剂量10、20和40 mg·kg-1分别灌胃给予莫诺苷后,主要药动学参数分别如下:Cmax为0.766±0.085,1.292±0.346和1.481±0.268μg·mL-1,Tmax为54±8.2, 60±0和60±0 min,T1/2为69.4±14.1, 103.9±23.4和90.2±32.6 min , AUC0-t为102.81±17.7, 166.04±30.42和193.36±45.56μg·min·mL-1。大鼠单次口服莫诺苷单体的绝对生物利用度在三个不同剂量10、20和40 mg·kg-1时,分别为7.0%、6.1%和3.6%。2.高、中、低三个浓度(0.202, 1.01和8.08μg·mL-1)的日内、日间精密度均小于15%,回收率均大于85%。大鼠灌胃给予莫诺苷20 mg·kg-1后,小肠中药物浓度最高,其次在肾和胃等组织,心、肝、肺和脾中浓度较低,脑组织中未检测到莫诺苷。3.胆汁中含微量的莫诺苷原型药物,粪便中未见莫诺苷原型药物;尿液排泄药动学试验表明,24 h内莫诺苷原型药物经尿排泄完全,排泄量主要集中在0～3 h,约占总排泄量的68.5%,但排泄总量不足给药量的2%。
结论:1.莫诺苷在大鼠体内吸收和消除均较快,在10～40 mg·kg-1范围内呈线性动力学,生物利用度不高;2.莫诺苷主要分布在小肠、肾和胃等组织,难以通过血脑屏障进入脑组织;在所研究的组织中,未见明显的特殊蓄积现象;3.莫诺苷原型药物主要经尿液排泄。
第五部分马钱苷和莫诺苷在大鼠体内外的代谢研究
目的:通过肠道菌厌氧培养,体外制备马钱苷和莫诺苷的代谢产物并确定其化学结构;研究马钱苷和莫诺苷及其代谢物在大鼠体内的过程,同时测定代谢产物的抗糖尿病药理活性,最终达到能够解释马钱苷和莫诺苷的代谢途径和作用机制的目的。
方法:1.取大鼠粪便,利用肠道菌培养的方法,通过TLC和制备HPLC等多种手段制备马钱苷和莫诺苷的代谢物,采用ESI-MS、1D-NMR及2D NMR等波谱技术确定代谢物的结构。2.口服马钱苷及莫诺苷后的血浆、尿液、胆汁、粪便及胃肠道内容物,采用HPLC-PDA分析,以保留时间及紫外最大吸收波长为依据,研究马钱苷和莫诺苷及其代谢物在大鼠体内的代谢途径。3.对4种代谢产物进行抗糖尿病活性筛选,测定的靶点是过氧化物酶体增生物激活受体gamma（PPAR gamma）。
结果:1.分别制备了马钱苷和莫诺苷各2个代谢产物（Mlog-1、Mlog-2、Mmor-1和Mmor-2）,并确定了化学结构,其中Mlog-1为马钱苷的苷元,Mlog-2、Mmor-1和Mmor-2经Chemical Abstracts（CA）检索为新化合物。2.马钱苷和莫诺苷体内外实验研究表明其在胃和肝脏代谢极少。马钱苷易被肠菌酶水解生成Mlog-1,并进一步转化为Mlog-2;马钱苷可吸收入血,并在大多数组织分布,血浆中未检测到Mlog-1和Mlog-2;马钱苷、Mlog-1和Mlog-2可通过尿液排泄,Mlog-2可通过粪便排泄,而马钱苷可通过胆汁排泄,而胆汁中未检测到Mlog-1和Mlog-2。莫诺苷易被肠道菌中的酶水解后经一系列变化生成Mmor-1,并进一步转化为Mmor-2;莫诺苷可吸收入血,并在大多数组织分布,血浆中未检测到Mmor-1和Mmor-2,莫诺苷和Mmor-1可通过尿液和胆汁排泄,Mmor-2可通过粪便排泄。3. Mmor-1和Mmor-2具有抗糖尿病活性。
结论:体外制备的马钱苷和莫诺苷代谢物与体内检测结果一致,可利用肠道菌培养体外制备代谢物。初步确定了马钱苷和莫诺苷的大鼠体内过程,同时阐明莫诺苷可在肠道被转化为Mmor-1和Mmor-2,发挥抗糖尿病作用的活性成分为其代谢物Mmor-1和Mmor-2。
