用组织工程方法构建SD大鼠全层皮肤的研究

近年来，随着组织工程技术的发展，研制人工皮肤替代物的研究报道逐渐增多。组织工程是目前生命科学领域的研究热点，相关的研究涉及到各个方面。其核心是应用工程学的原理和方法与生命科学相结合，发展能恢复、保持或改善功能的生物替代品。本实验运用组织工程学原理，成功在体外构建了SD大鼠全层皮肤，实验主要包括以下内容： 1．从SD仔鼠皮肤同时获取角朊细胞和真皮成纤维细胞的多种方法的比较：为了简便快捷的获得大量最佳生长状态的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞。用0.25％胰酶、35mg/ml热溶素和9.0U/ml Dispase分别在不同条件下处理皮肤标本，观察表皮与真皮的分离情况，并分别培养角朊细胞和真皮成纤维细胞，观察比较细胞的贴壁率和克隆形成率，通过MTT和BrdU检测观察细胞的生长状态，并分别用不同方法获得的细胞构建组织工程皮肤。结果表明，使用9.0U/ml Dispase对表皮和真皮的分离效果最好，从而可以简便快捷的获得大量生长状态良好的角朊细胞和真皮成纤维细胞以作为皮肤组织工程的种子细胞，同时也显示出消化方法、时间和温度对于保持细胞活力的重要性。 2．角朊细胞在三种不同培养基中的生长状态：配制FAD、MCDB153(-)、MCDB153(+)三种不同的培养基来培养SD大鼠的角朊细胞，通过细胞曲线、MTT检测、流式细胞仪分析观察细胞的生长状态。结果显示细胞在无血清培养基中生长良好，而加入表皮生长因子和促进增殖的垂体提取物可以进一步改善 第四军医大学硕士学位论文 细胞的生长状态。 ｝EGF对真皮成纤维细胞中CyCIinDI和CDK4表达的影响：用含 100 mL·L’胎牛血清的 DMEM，力入 50mg·L‘的 EGF培养 SD大鼠的真皮成纤维细胞，通过MTT检测、流式细胞仪分析 观察细胞的生长状态，免疫组化检测 cyclinDI和 CDK＊的表达， 结合流式细胞仪分析来观察细胞的周期变化。结果显示 5 0 m g·L’的 E G F对真皮成纤维细胞的生长有极大的促进作用， 促进了细胞周期蛋白cyclinD和CDK4的表达，使细胞GI期 变短。 4．三维立体培养中不同浓度的胶原对成纤维细胞生长的影响：分 离卜二天SD仔鼠背部皮肤的成纤维细胞，分别种入6．4mg／ml， 5．3mg；’ml，4mg／ml的胶原中，光镜观察立体培养条件下成纤维 细胞的生长状态和细胞数量，并进行统计分析。结果显示 6．4mg／ml的胶原浓度最适宜于成纤维细胞的生长。 5．SD大鼠全层组织工程皮肤的制备：分离SD仔鼠角阮细胞和成 纤维细胞。将成纤维细胞种植入牛1型胶原凝胶中，培养4天后， 将角肮细胞接种在凝胶的表面，继续培养3 天，然后将凝胶移 至气液面进行复层化并促使其成熟。结果显示构建的组织工程 全层皮肤是一种良好的生物活性皮肤替代物，可用来修复全层 皮肤缺损。 6．bFGF和FN在同种异体组织工程皮肤促进大鼠皮肤缺损愈合中 的表达：以新生SD大鼠皮肤的角阮细胞和真皮成纤维细胞构建 组织工程皮肤并将其移植到成年Wi star大鼠，通过HE染色、 兔疫组织化学方法对移植后不同时间的组织工程皮肤进行检 －＋－ 第四军医大学硕士学位论文 测，观察创面愈合过程中bFGF、FN 的表达变化及其与组织修 复的关系。结果显示bFGF、FN在组织工程皮肤促进大鼠皮肤 缺损愈合中发挥了重要的作用。