六神丸诱导白血病细胞凋亡及对凋亡相关基因的影响

目的： 白血病是一种造血组织的原发疾病，其病理特征是骨髓及造血组织中有广泛的白血病细胞异常增生并浸润其他组织器官。细胞凋亡是由多种因素参与调控的主动生理过程，按细胞或机体自身设置的程序进行，直到细胞被吞噬，以保持机体和组织的自稳，对维持正常的造血起着重要作用。一旦细胞凋亡受到抑制，机体不能及时清除过多的、受损的或恶变的细胞，就会发生肿瘤。因此，诱导恶变的白血病细胞凋亡成为治疗本病取效的重要途径之一。 六神丸经导师戴锡孟教授多年治疗白血病的临床证实，具有良好疗效。在此基础上本研究采用白血病细胞体外培养，以细胞形态、DNA断端标记、DNA电泳及流式细胞仪定量分析等指标观察六神丸对白血病细胞的诱导凋亡作用，并采用分子生物学方法观察其对凋亡相关基因表达的影响，探讨该复方治疗白血病的机理。 方法： 1 细胞培养 用RPMI—1640培养液，悬浮细胞常规培养方法体外培养NB4、HL—60细胞。 2 药物提取 以乙醇回流法提取六神丸有效成分，配成无色药液。 3 六神丸对白血病细胞增殖的抑制作用 MTT法 4 细胞凋亡的检测 4．1 形态学观察 以离心涂片机制成细胞涂片，吉姆萨染色，光学显微镜下观察细胞形态变化。 4．2 凋亡细胞DNA电泳 常规氯仿／异戊醇法提取细胞DNA，进行琼脂糖凝胶电泳。 4．3 原位缺口标记法(TUNEL) 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记技术 4．4 流式细胞仪定量分析 用溴化丙啶(PI)染色，流式细胞仪测定细胞凋亡率及细胞周期的变化。用PI／Annexin V双标法，流式细胞仪测定细胞凋亡率。 中文摘要 5对凋亡相关基因表达的影响 采用RT一PCR方法观察基因bel一2、P53、c mRNA表达的变化。 六神丸能抑制NB4、HL一60细胞增殖，抑制率与药物作用时间明显相关， 药物作用48h后，增殖抑制率均超过60%。呈现一定的量效关系。 2六神丸作用后，细胞形态呈现出凋亡特征。50u岁mL六神丸作用32h后， NB4和Nl二一60细胞DNA电泳表现为典型的阶梯状条带。原位缺口标记法测定 不同浓度六神丸对细胞均有明显的诱导凋亡作用，凋亡率与作用时间和药物浓度 成正比，较高浓度(100u岁ml)六神丸作用32h的凋亡率最高，NB4细胞为64.3%， HL一60细胞为68.6%。AnnexinV用I双染流式细胞仪测定结果显示50u岁mI六神 丸作用32h后，细胞凋亡率最高，NB4细胞为37.7%，闭二一60细胞为23.2%。 加大药物浓度，凋亡率下降。 3六神丸可下调两细胞株bc卜2 mRNA表达，使c一myc n1RNA表达增强， 并上调NB4细胞p53基因mRNA的表达· 结论: 体外实验表明，六神丸可抑制急性粒细胞白血病MZ细胞HL一60和急性早 幼粒细胞白血病M3(APL)细胞NB4的增殖，抑制率高，抑制作用呈现时间依 赖性。六神丸可诱导细胞凋亡，细胞从形态、生化等方面表现出凋亡特征。细胞 经药物作用后，凋亡抑制基因bel一2 mRNA表达下降，促凋亡基因c一myc及p53 n承刹A表达增强。这可能是六神丸诱导细胞凋亡的机理之一。