大黄素对非酒精性脂肪肝大鼠的干预作用及可能机制研究

目的 利用高脂饮食复制非酒精性脂肪肝(NAFLD)大鼠模型,观察大黄素对NAFLD模型大鼠的干预作用,并探讨大黄素对NASH大鼠肝脏TNFa、IL-1β表达的可能影响,以及对NASH大鼠肝脏LPS-TLR4-NF-KB信号转导通路的可能作用。初步探讨大黄素防治NAFLD的作用及可能的药理作用机制,为临床应用大黄素治疗NAFLD提供实验依据。方法 42只雄性SD大鼠适应性饲养一周后,按体重编号,完全随机分为正常组8只和高脂造模组34只。正常组予普通饲料喂养,高脂造模组予高脂饲料喂养,均自由饮水。实验第4周末从高脂造模组随机抽取2只大鼠,处死后取其肝脏行肝组织病理学检查,以诊断有明显脂肪肝改变。造模成功后,正常组(A组)8只大鼠继续予普通饲料喂养,同时予生理盐水10mL/kg/qd灌胃；剩余的造模组32只大鼠随机分为模型组(B组)8只、大黄素低量组(C组)8只、大黄素高量组(D组)8只和二甲双胍组(阳性对照组)(E组)8只,均继续予高脂饲料喂养。模型组在予高脂饲料的同时予生理盐水10mL/kg/d灌胃(ig),大黄素低、高剂量组在予高脂饮食的同时分别予大黄素20mg/kg/d和40mg/kg/d[即大黄素混悬液(2或4g/L)10 mL/kg/d],ig,阳性对照组在予高脂饲料的同时予以二甲双胍150mg/kg/d, ig,均灌胃8周。于实验第12周末处死大鼠前1d,大鼠剪尾取血,测定血糖水平。实验第12周末,处死大鼠,门静脉取血和下腔静脉取血,取肝右叶组织数块,称大鼠体重和肝脏重量,计算肝指数,观察大鼠肝脏大体形态,光镜下HE染色观察肝脏组织病理,计算肝脏脂肪变程度分级和肝脏炎症分级。全自动生化仪检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、血清胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)水平,并计算OGTT。免疫组化检测肝组织TNFa, NF-κB的表达。RT—PCR法检测各组大鼠肝脏组织IL-1βmRNA、TLR4 mRNA的表达。鲎试剂法检测门静脉血浆内毒素水平。Western-blotting法检测肝脏组织TLR4的表达。酶联免疫吸附测定(ELISA)双抗体夹心法测定肝脏组织IL-1β水平。结果 本实验以高脂饲料喂养4周成功复制了大鼠单纯性脂肪肝(NAFL),12周成功复制了大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型。12周末时B组大鼠体重明显高于A组,(P<0.05), C、D组与B组相比差异无统计学意义(p>0.05)。B组大鼠肝指数明显高于A组(p<0.01),C、D、E组肝指数较模型组均明显降低(p<0.01)。B组大鼠血TC、TG显著高于A组(p<0.01),C、D组血TC、TG较B组均明显降低(p<0.01),D组血TC、TG比较C组血TC、TG降低,差异有统计学意义(p<0.01)。与B组比较,C、D组大鼠肝脏脂肪变差别不明显(P>0.05)。与B组比较,C、D组肝脏炎症程度显著降低,(p<0.05,p<0.01),且D组肝脏炎症程度比较C组降低,差别有统计学意义(p<0.01)。与B组比较,C、D大鼠血清ALT、AST水平降低,有统计学差异(p<0.01),且D组大鼠血清ALT、AST水平较C组显著降低(p<0.01)。免疫组化检测显示,B组TNFa的表达较A组增强(P<0.01),与B组相比,D组大鼠TNFa表达明显减弱(p<0.05)；B组肝脏NF-KB的表达较A组增强(P<0.01),D组肝脏NF-KB的表达较B组显著降低(P<0.01)。TNFa与血清转氨酶之间,有良好的相关性。RT-PCR检测结果显示,与B组相比,D组大鼠肝脏IL-pmRNA显著下调P<0.05),C组与B组相比无显著差异(P>0.05),与B组比较,D组显著下调肝脏组织TLR4mRNA的表达(P<0.05)。ELISA法测定显示与B组比较,C、D组大鼠肝脏IL—1β的表达显著降低(P<0.01)。鲎试剂法检测内毒素水平,B组大鼠门静脉内毒素水平比较A组显著升高(P<0.01),D组大鼠门静脉内毒素水平比较B组有显著降低(P<0.01),C组大鼠门静脉内毒素水平比较B组有降低,但差别无显著性(P>0.05)。Western-blotting法检测肝脏TLR4蛋白表达结果显示,与B组比较,D组大鼠肝脏TLR4蛋白表达显著下调(P<0.05)。结论 1.大黄素可有效干预非酒精性脂肪性肝病大鼠模型的形成。 2大黄素有减低非酒精性脂肪性肝病大鼠血清TG、TC作用。 3.大黄素可明显减轻非酒精性脂肪性肝病中的炎症反应。 4抑制肝脏TNF-α、IL-1β的表达可能是大黄素发挥NASH抗炎作用的机制之一 5.大黄素具有减少NASH大鼠内毒素产生的作用。 6.大黄素可能通过下调损伤信号分子TLR4、NF-KB的表达抑制NASH炎性因子的产生。