目的
1.观察冠心病患者临床流行病学特点,研究冠心病患者的中医证型分布特点,并探讨前炎性因子TNF-α以及粘附分子E-selectin、ICAM-1在冠心病不同中医证候中的表达,分析它们之间的相关性,从中医证候的角度,为生物标志物对冠心病病情评估提供参考。
2.通过TNF-α刺激人微血管内皮细胞(HCMEC),模拟冠心病过程中的炎性反应,研究黄芪多糖对中性粒细胞与HCMEC之间粘附反应的作用,从蛋白表达、基因转录的角度探讨黄芪对内皮细胞炎性反应的保护作用。
方法
1.对243例冠心病患者进行中医证候调查,观察患者各中医证候分布情况。观察患者的血凝、血脂等理化指标变化规律,并测定冠心病各中医证候患者血清中炎性生物标志物TNF-α和E-selectin、ICAM-1的水平,运用医学统计学的方法,对各证候间TNF-a、E-selectin、ICAM-1的水平进行统计分析,探讨它们之间的差异性。同时,探讨TNF-α、E-selectin、ICAM-1与冠心病患者中医证候、血凝、血脂之间的相关性。
2.应用细胞分子生物学方法探讨黄芪多糖对TNF-α诱导的中性粒细胞与HCMEC粘附反应的影响及作用机制：制备外周血中性粒细胞,用TNF-α刺激诱导中性粒细胞与HCMEC之间的粘附反应,并以黄芪多糖对该粘附反应进行干预,测定细胞粘附率,探讨黄芪多糖对粘附反应的影响。运用Western-blot方法测定HCMEC细胞内粘附分子E-selectin、ICAM-1的蛋白表达。运用RT-PCR方法,测定HCMEC细胞内E-selectin、 p38MAPK、ATF-2的mRNA表达,从蛋白、基因角度探讨黄芪多糖对粘附分子、细胞信号转导通路的影响,从而了解黄芪多糖对细胞粘附反应干预作用的机制。
结果
1.入选243例冠心病患者的主要证候分布按人数多少排列顺序是：血瘀证>气虚证>痰浊证>气滞证>阴虚证>阳虚证>寒凝证。气虚血瘀证是冠心病的基本证候(占患者总人数的58.03%)。
2.冠心病中医证候与血脂的关系：气虚证组与非气虚证组比较血脂水平均无显著性差异(P>0.05)。血瘀证组TC、LDL-C水平显著高于非血瘀证组,而HDL-C水平显著低于非血瘀证组(P<0.05)。气虚血瘀证组HDL-C水平显著低于非气虚血瘀证组(P<0.05)。血瘀证与LDL正相关。气虚血瘀证与HDL-C负相关。痰浊证与TC、TC正相关,与HDL-C负相关。
3. TNF-α、sICAM-1、sE-selectin水平与冠心病亚型、年龄分层、中医证候的关系：冠心病患者各亚型TNF-α水平均高于正常组,UAP组、AMI组显著高于SAP组(P<0.05)。冠心病患者各亚型sICAM-1、sE-selectin水平均高于正常组,UAP组、AMI组显著高于SAP组。(P<0.01,P<0.05)。冠心病老年组、年轻老年组TNF-α水平显著高于青年组、中年组(P<0.01,P<0.05)。高龄老年组、年轻老年组sICAM-1、sE-selectin水平显著高于青年组、中年组(P<0.01)。气虚证组、血瘀证组、气虚血瘀证组患者血清中TNF-α、sICAM-1、sE-selectin水平均高于正常组(P<0.01)；气虚证组与非气虚证组TNF-a水平有显著性差异(P<0.05),血瘀证组TNF-α水平明显高于非血瘀证组(P<0.05)。血瘀证组sICAM-1、sE-selectin水平明显高于非血瘀证组(P<0.05)。血瘀证与TNF-α存在极显著相关性(P<0.01),血瘀证与sE-selectin、sICAM-1有显著相关性(P<0.05)。气虚证与TNF-α、sICAM-1、sE-selectin有显著相关性(P<0.05)。气虚血瘀证与TNF-α、sICAM-1、sE-selectin有极显著相关性(P<0.01,)。
4.粘附分子与血凝、血脂的相关性：sICAM-1与FIB、LDL-C正相关,与HDL-C负相关(P<0.05)；sE-selectin与FIB、LDL-C正相关(P<0.05)。
5.TNF-α与sICAM-1、sE-selectin的相关性：TNF-α与sICAM-1、sE-selectin存在显著性相关(P<0.05)。
6.APS对TNF-α诱导的中性粒细胞(PMN)与HCMEC粘附反应的影响：模型组心脏微血管内皮细胞(HCMEC)出现皱缩、重叠,细胞大片脱落,出现炎性损伤。APS高、中、低剂量组细胞炎性损伤的程度明显低于模型组。模型组HCMEC与PMN的粘附比正常对照组明显增加(P<0.01)。APS能降低HCMEC与PMN之间的粘附,其中APS高、中剂量组及P38MAPK抑制剂组的PMN粘附数量与模型组比较差异极显著(P<0.01),APS低剂量组PMN粘附数量与模型组比较差异显著(P<0.05),实验结果提示高、中、低浓度的APS可明显降低前炎性因子TNF-α诱导的HCMEC与PMN之间的粘附作用。
7. APS对HCMEC细胞E-selectin、ICAM-1蛋白表达的影响：与正常对照组比较,模型组E-selectin、ICAM-1蛋白表达明显增加(P<0.01)；与模型组比较,黄芪多糖高剂量组、p38MAPK抑制剂组E-selectin、ICAM-1蛋白表达显著降低(P<0.01)。
8.APS对HCMEC细胞p38MAPK、ATF-2、E-selectin基因表达的影响：与正常对照组比较,模型组HCMEC中p38MAPK和E-selectin mRNA表达明显增加(P<0.01), ATF-2mRNA表达也明显增加(P<0.05)；与模型组比较,APS高、低剂量组与p38MAPK抑制剂组组的p38MAPK、ATF-2、E-selectin mRNA表达显著降低(P<0.05)。
结论
1.冠心病证候要素以血瘀证、气虚证最多见,证候特点以组合证候多见,三证相兼的最多见,气虚血瘀证是冠心病的基本证候。冠心病不同中医证候之间血脂水平差异显著,血瘀证、气虚证、气虚血瘀证与血脂存在显著相关性。不同中医证候之间炎性生物标志物TNF-α、sICAM-1、sE-selectin的水平差异显著,提示不同中医证候存在不同的生物学基础。血瘀证、气虚证、气虚血瘀证与TNF-α、sICAM-1、sE-selectin具有显著相关性,提示冠心病血瘀证、气虚证、气虚血瘀证发生过程中与炎症反应关系密切炎性标志物TNF-α、sICAM-1、sE-selectin的水平与冠心病病情轻重程度相关,对临床诊疗具有一定的参考价值。
2.经TNF-α活化后,中性粒细胞与HCMEC粘附增加,TNF-α参与了细胞间的炎性损伤和粘附反应。APS能够减轻细胞间的粘附反应,降低经TNF-α活化后HCMEC细胞内粘附分子E-selectin、ICAM-1的蛋白表达和基因转录。同时,还能抑制P38MAPK及其转录因子ATF-2的基因转录。
本研究表明气虚血瘀证是冠心病的基本中医证型,气虚证、血瘀证、气虚血瘀证与炎性生物标志物具有显著相关性,且与病情程度相一致,说明炎症反应参与了冠心病的发展过程,炎症标志物能够在一定程度上评估患者的炎症反应程度,对病情评估有一定参考作用。黄芪多糖对炎性细胞与血管内皮细胞的粘附反应具有一定的抑制作用,其机制可能是药物通过抑制P38信号通路的激活,减少其下游转录因子ATF-2的基因转录,从而降低粘附分子E-selectin、ICAM-1的蛋白表达和基因转录。研究结果提示黄芪多糖对细胞炎性损伤具有一定的保护作用。
