ClC-3氯通道参与TGF-β/Smads通路调控甲状旁腺激素对MC3T3-E1细胞成骨分化的作用研究

研究背景:骨质疏松是临床上最常见的骨代谢疾病之一,主要表现为疼痛、易骨折,严重者可致呼吸功能下降,显著影响病患的生活质量,因而骨质疏松的治疗越来越受到人们的关注。甲状旁腺的主细胞能够分泌PTH,从而来调控骨组织代谢以及来维持机体的钙平衡。然而,PTH能够双向地调节骨组织的代谢。具体言之,间断PTH刺激下,小剂量时能够促进骨组织的形成;持续PTH刺激下,大剂量则可以促进骨组织的吸收。但其具体的作用机制尚未探明,因而未能应用于临床上骨质疏松患者的治疗,因此进一步阐明PTH促进骨形成的机制将为其应用于临床提供更多的理论依据。ClC-3电压门控氯通道存在于成骨谱系细胞中,在对成骨细胞的作用上与PTH有许多共同点。前期研究发现,PTH刺激能显著上调成骨细胞中ClC-3的表达。并且PTH能通过ClC-3调节下游成、破骨相关基因的表达,但其分子机制并不十分明确。有研究认为,pth与tgf-β1在膜受体水平上可相互影响,共同调节骨吸收和骨形成,但其作用机制非常复杂还不清楚。在前期研究中我们发现clc-3也参与了成骨细胞中tgf-β1信号的调控,tgf-β可以调节成骨细胞的增殖与分化,其中tgf-β1通过smad2/3信号调控核心结合蛋白因子runx2的表达,进而促进成骨作用。由此可见,clc-3不仅和pth在骨代谢的调节上有密切关系,还参与了tgf-β1信号的调控。所以,clc-3如何介导tgf-β1与pth之间的相互作用关系,还有待进一步研究。本课题旨在研究在pth间断刺激下,clc-3氯通道、tgf-β1及下游信号分子之间的相互关系,为进一步深入研究pth的促成骨分化作用机制提供新的思路。研究目的:本研究旨在通过调节clc-3氯通道基因及tgf-β1基因的不同表达水平来初步探究clc-3氯通道在pth调节成骨分化过程中的作用机制。研究内容:(1)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,观察两者基因、蛋白表达的表达情况。(2)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调及共同下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,研究其下游成、破骨相关基因的表达情况。(3)研究在1×10-9mpth对mc3t3-e1细胞每隔6小时间断刺激下,分别下调及共同下调tgf-β1和clc-3基因表达水平后,检测成骨细胞体外矿化能力的变化。研究方法:(1)采用基因转染的方法,分别用特异性sirna下调成骨细胞mc3t3-e1中tgf-β1及clc-3基因的表达水平,同时利用real-timepcr检测mc3t3-e1细胞中tgf-β1和clc-3基因表达水平,成、破骨相关基因(runx2、alp、bsp、oc、opg及rankl)表达水平。(2)通过免疫印迹方法及细胞免疫荧光法检测pth刺激下tgf-β1和clc-3氯通道蛋白表达的影响,初步分析两者之间的关系。(3)利用茜素红染色及计算钙结节观察成骨诱导培养及pth刺激培养下各组mc3t3-e1细胞的体外矿化能力。研究结果:(1)10-9 M的PTH间断刺激时,MC3T3-E1细胞中仅下调TGF-β1基因表达后,ClC-3氯通道基因及蛋白表达水平增强;仅下调ClC-3氯通道基因后,TGF-β1基因及蛋白表达水平增强。(2)10-9 M的PTH间断刺激时,在分别下调MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因后,成、破骨相关基因(Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl)表达水平较对照组明显降低。(3)10-9 M的PTH间断刺激时,共同下调MC3T3-E1细胞中ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因之后,成、破骨相关基因(Runx2、Alp、Bsp、Oc、Opg及Rankl)较对照组无明显差异。(4)10-9 M的PTH间断刺激时,成骨诱导液诱导成骨的能力优于PTH刺激,在分别下调ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因表达水平后,MC3T3-E1细胞的体外矿化能力较对照组均下降。在共同下调两者之后,其体外矿化能力较对照组无明显差异。研究结论:(1)在PTH刺激促进MC3T3-E1细胞成骨分化过程中,ClC-3与TGF-β1信号可相互影响。(2)ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因均可响应PTH的间断刺激而发生变化,进而影响下游成、破骨相关基因的表达。(3)不同表达水平的ClC-3氯通道基因和TGF-β1基因对PTH刺激促进MC3T3-E1成骨分化作用有一定影响。