中药莪术化学成分分析及药代动力学研究

莪术始载于《药性论》,为姜科植物蓬莪术Curcuma phaeocaulis Val、广西莪术Cucuma kwangsiensis S.G. Lee et C.F. Liang或温郁金Curcuma wenyujin Y.H. Chen et C. Ling的干燥根茎,后者习称―温莪术‖。其性味辛、苦、温,归肝、脾经,具行气破血、消积止痛功效。临床用于治疗癓瘕痞块、瘀血经闭、食积胀痛、早期宫颈癌等症。研究表明,莪术中主要有效成分莪术油的含量较高,莪术油具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗氧化和保肝等广泛的药理活性,其中抗肿瘤活性物质主要为莪术醇(curcumol)、?-榄香烯(?-elemene)、莪术二酮(curdione)等。 我国莪术药材资源丰富,约有20个品种,主要分布于四川、福建、浙江、广西等地,原料易得。本课题旨在建立鉴别与区分莪术化学成分方法;同时进行莪术提取物的质量标准研究;对莪术提取物中活性成分莪术二酮进行初步的药代动力学探索研究。具体研究内容如下: 1.顶空气相色谱-质谱联用结合化学计量学方法用于莪术化学成分分析与质量控制 本课题首次采用顶空气相色谱-质谱(HS-GC/MS)联用技术分析中药莪术化学成分,采用HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25μm)石英毛细管色谱柱,进样口温度为250°C,柱初始温度为50°C,保持3 min,以20°C/min升至150°C,最后以2°C/min升至200°C,保持10min。载气为高纯度氦气,流速1.0 ml/min,分流比10:1。顶空瓶平衡温度为90°C,平衡时间为30 min,进样量为1.5 ml,在24 min内分离得到68种化学物质。再将HS-GC/MS与化学计量学的方法相结合,通过分析莪术中的化学成分,对中药莪术的来源进行分析,目的用于鉴别与区分不同产地来源的莪术药材,并找到对不同质量的莪术药材起主要分类作用的特征性成分。 2.液相色谱-质谱联用在莪术化学成分分析研究中的应用 由于莪术药材中大多数为挥发性成分,虽然采用GC-MS技术能很好的对其进行分析,但是莪术药材中有许多分子量相近或相同的化学成分,单靠GC-MS无法对其进行鉴别。因此我们首次采用了超高效液相色谱-飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)联用技术对莪术化学成分进行了初步鉴别,检测莪术中分子量相近的化学成分,其色谱质谱条件为:采用Agilent XDB-C18 (5μm, 250 mm×4.6 mm I.D.)色谱柱,流动相采用乙腈-水(含0.1%甲酸),柱温为30°C,流速为0.4 ml/min。离子源为ESI源,正离子模式,质谱扫描范围100-1100 m/z,毛细管电压4500 V,干燥气流速为11 l/min,干燥气温度为350°C;雾化器压力为50 psig,裂解器电压为150 V。在35 min内初步鉴别出12个化学成分,从中我们发现有相同质荷比为237.1854的三种物质,它们是neocurdione、curdione、curcumol,相同质荷比为219.1744的γ-tumerone、germacrone这两种物质,单从分子量来看,无法将其明确区分。因此,结合液相色谱-离子阱质谱(HPLC-QIT/MS)联用技术对其中3种成分curdione、curcumol、germacrone的对照品进行了多级裂解分析。色谱质谱方法为:采用Agilent ZORBAX SB-C18 (3.5μm,100 mm×2.1 mm I.D.)色谱柱,流动相采用乙腈-水(含0.5%甲酸),柱温为30°C,流速为0.3 ml/min,分析时间为25 min,通过多级打击,推测其可能的裂解途径。最后,根据推测的途径,确认了以上五种物质。 3.气相色谱-质谱联用测定莪术中5种主要指标性成分的含量 а-哌烯、β-榄香烯、莪术醇、吉马酮、莪术二酮是产生药理活性的主要化合物。因此,在莪术油的提取过程中,对其进行质量控制具有重要意义。本研究中,采用GC-MS联用技术,建立了5种主要指标性成分的含量测定方法,标准曲线为а-哌烯:y = 0.3387x + 0.0036 (r=0.9987),线性范围0.0113-0.5631μg/ml;?-榄香烯:y = 0.0636x -0.0104 (r=0.9997),线性范围0.2501-12.5061μg/ml;莪术醇:y=0.0285x- 0.0148 (r=0.9993),线性范围0.5155-25.7339μg/ml;吉马酮:y=0.1138x- 0.0932 (r=0.9996),线性范围3.3326-166.6294μg/ml;莪术二酮:y=0.1161x- 0.073 (r=0.9996),线性范围1.9348-96.7398μg/ml。同时,我们还比较了不同产地、不同品种的16批次莪术药材,发现含量差异较大。本法可以快速、简单、有效的对莪术进行质量控制。 4.莪术中莪术二酮的药代动力学研究 莪术二酮具有抗炎镇痛的药理作用,对其进行初步药代动力学评价有利于进行深入的研究。本文首次建立了血浆样品中莪术二酮的分析方法,实验中采用甲醇蛋白沉淀法对血浆样品进行预处理,建立了以原人参二醇为内标的UPLC-QTOF/MS检测大鼠血浆中莪术二酮的体内分析方法。色谱分析采用Agilent Extend-C18 column (1.8μm,50 mm×2.1 mm I.D.)色谱柱;流动相为:水(A,含0.1%甲酸)-乙腈(B,含0.1%甲酸),梯度洗脱程序为0-5 min,40-55% B;5-15min,55-85% B,柱温为30°C,流速为0.3 ml/min。离子源为ESI源,正离子模式,质谱扫描范围100-1100 m/z;毛细管电压4500 V,干燥气流速11 l/min,干燥气温度为350°C;雾化器压力为50 psig,裂解器电压为150 V。本文建立的生物样品预处理方法和UPLC-QTOF/MS分析测定生物样品中莪术二酮的含量,该成分线性范围在0.12-12.26μg/ml内,精密度和稳定性实验结果均符合要求。血浆中内源性物质均不干扰样品峰的测定,该物质最低定量限为6.5 ng/ml。该方法简便、快速、可靠,适合于生物样品的含量测定。并成功运用于SD大鼠口服、腹腔注射给药后药代动力学研究,对莪术的后续药理等研究具有指导意义。