菊花近缘种属植物抗寒性评价及抗寒分子机制研究

菊花(Chrysanthemum grandiflorum(Ramat.)Kitarn.),作为世界四大切花和我国十大传统名花之一,具有很高的观赏和经济价值,在花卉生产中占有重要地位。然而,我国长江中下游及长江以北地区的冬季低温严重影响了菊花生长发育,导致观赏品质下降,成为限制我国菊花产业发展的重要因素。开展菊花抗寒育种、培育抗寒新品种,是解决这一问题的根本途径。菊花近缘种属野生种质资源常具有栽培品种缺乏的某些抗逆性,对拓宽菊花种质资源和基因库有重要应用价值。因此,开展菊花近缘种属野生种质资源的抗寒筛选,获得典型抗寒材料,探索其抗寒生理及分子机制,有利于加快推动菊花抗寒种质创新和新品种选育进程。本文的研究内容及主要结论如下： 1.对45份菊花近缘种属野生资源的抗寒性进行了评价,结合冬季脚芽叶片半致死温度(LT50),将抗寒性进行分类,强抗寒(LT50<-20℃)：紫花野菊、沈阳野菊、异色菊、太行菊和北京植物园野菊等；中等抗寒(-20℃≤LT50≤-10℃)：黄金艾蒿、成都峰峡野菊、菊花脑等；不抗寒(LT50>-10℃)：若峡滨菊、神龙架野菊和达摩菊等。进一步通过脚芽恢复生长试验进行验证,发现脚芽冷冻处理后的存活率与LT50呈显著负相关,表明半致死温度可作为菊花近缘种属抗寒性评价的一个可靠指标。 2.以强抗寒异色菊和不抗寒若峡滨菊为材料,分析了冷驯化(4℃,1d、7d、14d和21d)条件下的抗寒差异。随着冷驯化时间的延长,两个菊属植物的半致死温度LT50呈现不同程度的下降；其中抗寒性强的异色菊从-7.3℃下降到-23.5℃,而抗寒性弱的若峡滨菊从-2.1℃下降到-7.1℃。测定了冷驯化过程中抗氧化酶(SOD、CAT和APX)活性和脯氨酸含量的变化,根据生物信息学从菊花EST数据库中电子克隆了抗氧化同工酶基因(Cu/Zn SOD、Fe SOD、Mn SOD、CAT和APX)、脯氨酸代谢相关基因(P5CS、OAT和PDH)以及冷调节相关基因(2个DREB家族基因、2个COR413家族基因和2个CSD家族基因),并进行了定量表达分析。结果发现,冷驯化使SOD、CAT和APX活性和脯氨酸含量的提高,其中异色菊提高的幅度显著高于若峡滨菊；基因表达分析显示SOD活性的提高主要来源于Mn SOD的表达增强,CAT和APX表达与其酶活性变化一致,P5CS和PDH表达与脯氨酸含量变化趋势一致；异色菊MnSOD、CAT、APX和P5CS表达的上升幅度显著高于若峡滨菊。冷调节相关基因表达分析结果显示,冷驯化诱导了DREBs、COR413s和CSDs基因表达的上调,其中异色菊的上升幅度均显著高于若峡滨菊。进一步分析发现,冷驯化初期抗寒性的提高来源于抗氧化系统的变化、脯氨酸含量的积累和冷调节基因的表达的综合作用,冷驯化后期抗寒性的提高来源于MnSOD, COR413s和CSDs等抗寒基因的表达的上调。 3. DREB家族基因在植物抗寒调控中发挥重要作用,为了进一步研究DREB基因的上游调控路径,从异色菊中分离到一个DREB家族基因CdDREBa(?)(?)启动子序列,其位于翻译起始位点上游1474bp的区域,PLACE数据库分析发现启动子中包括很多胁迫相关顺式作用元件(MYC-box, MYB-site, GT-1和W-box).通过启动子融合β-葡萄糖苷酸酶基因在拟南芥中表达分析,发现不同5’缺失的CdDREBa启动子在低温和盐胁迫下的活性存在差异。GUS组织化学染色和定量检测结果显示,启动子中一段80bp(-430～-351bp)的序列同时受低温和盐胁迫响应。将这个80bp的片段与35S mini启动子融合表达,显著促进了盐胁迫下GUS基因的表达。进一步通过内部缺失方法,发现一个低温抑制元件位于-430～-390bp区域和一个盐诱导元件位于-385～-351bp区域。结果显示,启动子中除了已知的MYC-box和GT-1元件受低温和盐胁迫响应外,我们发现的两个响应元件区域在胁迫响应过程中同样发挥着重要作用。 4.ICE家族基因在冷驯化调控植物抗寒路径中至关重要,以异色菊为材料,分离到一个ICE家族同源基因Cd1CE1,编码471个氨基酸,序列分析与其他物种ICEs具有高度相似性。通过荧光定量表达分析发现,低温、盐和ABA均诱导了Cd1CE1基因的表达；进一步克隆了Cd1CE1启动子,位于翻译起始位点上游1682bp的区域,序列分析发现了很多胁迫相关作用元件。构建35S::Cd1CE1-GFP表达载体,基因枪轰击洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现Cd1CE1定位于细胞核。采用毕赤酵母真核分泌表达系统,对Cd1CE1蛋白进行表达并纯化,凝胶阻滞(EMSA)试验证明Cd1CE1蛋白能与CdDREBa启动子中的MYC元件特异结合；酵母单杂交试验证明Cd1CE1具有转录激活活性。这些初步表明,异色菊中存在ICE1-DREB调节路径。 5.为了进一步证明Cd1CE16(?)抗寒调控功能,将Cd1CE1基因转到拟南芥中,并进行抗冻表型分析和分子机制探索。结果发现,不同温度驯化均提高了拟南芥抗冻性,异源表达异色菊Cd1CE1基因显著提高了不同温度驯化下抗冻性。23-4℃驯化下,Cd1CE1促进了CBFs及下游COR15a、COR6.6和RD29a三个抗冻基因的表达,与拟南芥At1CE1基因功能相似；而在23-16℃驯化条件下,Cd1CE1促进了三个抗冻基因的小幅上调,而对CBFs表达没有影响。23-16℃驯化诱导了miR398(?)(?)下调,促进了CSD1和CSD2的上调,进一步研究发现miR398负向调控拟南芥抗冻性,而CSDs正向调控抗冻性；miR398-CSDs路径参与了23-16℃驯化诱导的抗冻性调节。Cd1CE1过量表达显著下调了23-16℃驯化后miR398的表达；Cd1CE1介导了miR398-CSDs路径,提高抗冻性。因此,不同温度驯化下,Cd1CE1通过两条不同路径调控拟南芥抗冻性。 6.大量研究证明ICE1蛋白存在转录后的翻译修饰,为了深入研究Cd1CE1的调控机制,应用酵母双杂交体系对Cd1CE1互作蛋白进行了筛选。结果表明,采用Clontech试剂盒,成功构建了对照和冷驯化下菊花叶片cDNA混合酵母文库,以pGBKT7-Cd1CE1-85为诱饵质粒,筛选了64个候选阳性克隆并测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与光合作用、氧化胁迫和翻译修饰等相关的候选蛋白；其功能预测表明Cd1CE1可能参与了多条信号转导途径,在抗逆调控中具有重要作用。