酶解鹿茸多肽促进人成骨细胞增殖分化的活性研究

本研究的目的：乙醇萃取鹿茸中有效物质后的残渣继续再利用。首先酶解乙醇提取鹿茸后的残渣得到了鹿茸多肽粗提物，再进一步分离与纯化得到活性鹿茸多肽混合物质。然后分析其理化性质以及生物活性，即考察其对人成骨肉瘤细胞（OS-732）分化与增殖的影响。 方法：凯氏定氮法测定含氮量，比较乙醇直接萃取鹿茸与酶解所剩鹿茸残渣的提取物的蛋白含量。采用Sephadex－G25凝胶柱层析（VAP-Ⅰ和VAP-Ⅱ）和高效液相色谱柱分离纯化得到活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）。质谱分析测定活性多肽（VAP-Ⅱ-A）混合物的分子量范围；分析与检测鹿茸多肽对人成骨肉瘤细胞（OS-732）分化与增殖的影响方法涉用IMDM血清培养基培养人成骨肉瘤细胞（OS-732），同时用含不同浓度活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）的血清培养液培养细胞，然后利用MTT法测定各组细胞增殖率，选择最佳细胞活性药物浓度。在此基础上，运用流式细胞术检测细胞周期变化，观察细胞通路抑制剂p38MAPK对细胞增殖生长的影响，检测细胞碱性磷酸酶（ALP）的活性。进一步采用Real-Time PCR的方法观察各组OS-732细胞BMP2，P21和（Cyclin）D1的mRNA相对含量差异。 结果：鹿茸萃取液中鹿茸蛋白含量11%，鹿茸残渣蛋白含量71.2%，鹿茸残渣酶解液提取物蛋白含量57.6%。分离纯化的活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）混合物分子量范围为500-700Da；用含活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）血清培养基处理细胞，通过MTT法确定药物作用最佳浓度为200ug mL；经过活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）处理后，细胞周期的生长期所占比例明显提高；细胞通路抑制剂p38MAPK对活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）作用后的细胞生长无明显抑制作用；检测OS-732细胞中BMP，P21，和（Cyclin）D1mRNA相对含量差异，其中BMP2和P21mRNA的相对含量提高了7倍。 结论：酶解乙醇萃取后的鹿茸残渣得到的活性鹿茸多肽（VAP-Ⅱ-A）分子量范围与乙醇提取物中所得的多肽分子量范围接近；含鹿茸多肽血清培养基作用细胞后细胞活性明显提高，表明酶解得到的多肽成分能够促进OS-732细胞的分化与增殖，进而为酶解鹿茸多肽的临床应用提供了理论依据。