梅毒螺旋体鞭毛蛋白经激活NLRC4炎症小体诱导人巨噬细胞表达IL-1β和IL-18

目的:探讨梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)重组鞭毛蛋白FlaB1(Tp0868)、FlaB2(Tp0792)和Fla B3(Tp0870)能否刺激THP-1源性人巨噬细胞活化NLRC4炎症小体产生促炎细胞因子白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)和IL-18,并通过观察NLRC4-siRNA和半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶-1(caspase-1)特异性抑制剂对Tp重组鞭毛蛋白诱导巨噬细胞产生促炎细胞因子IL-1β和IL-18的影响,进一步研究NLRC4炎症小体在鞭毛蛋白诱导IL-1β和IL-18产生中的作用及其相关机制。方法:从GenBank中获取tp0868、tp0792、tp0870全基因序列,设计引物,以Tp Nichols标准株DNA为模板,采用PCR技术扩增tp0868、tp0792、tp0870全基因片段,构建pET28a-Tp0868、pET28a-Tp0792、pET28a-Tp0870原核表达载体,测序鉴定后转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导重组鞭毛蛋白Fla B1、FlaB2和FlaB3的表达。采用SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分析、鉴定表达产物,Ni-NTA亲和层析柱纯化重组鞭毛蛋白,透析复性法复性重组蛋白,多粘菌素B去除重组蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3中的内毒素。采用鲎试剂测定重组蛋白中内毒素含量,BCA法测定蛋白浓度。采用佛波酯(PMA)处理THP-1细胞12h,25μg溶血性链球菌溶血素O(SLO)预处理细胞30min后再用0.1～10μg/mL重组鞭毛蛋白FlaB3刺激细胞,并于0h、2h、4h、6h、12h、24h收集上清及细胞,实时聚合酶链反应(Real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测NLRC4、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing a CARD,ASC)、caspase-1、IL-1β和IL-18mRNA转录水平,ELISA检测IL-1β、IL-18表达水平,Western blot检测NLRC4、caspase-1表达水平。采用si-RNA干扰NLRC4,Caspase-1特异性抑制剂VX765抑制caspase-1表达后,再用重组蛋白FlaB3刺激巨噬细胞,RT-PCR、ELISA和Western blot检测NLRC4、ASC、caspase-1、IL-1β和IL-18的水平。结果:(1)成功构建pET28a-Tp0868、pET28a-Tp0792、pET28a-Tp0870重组质粒,经测序鉴定后证实与目的基因一致。转化至E.coli BL21(DE3)表达菌后,IPTG诱导表达相对分子量(Mr)大小约为36kDa(FlaB1)、35 kDa(FlaB2)和34kDa(FlaB3)的重组蛋白。(2)经分析,重组鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3均为包涵体蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化获得纯度较好的重组鞭毛蛋白,Western blot鉴定示纯化蛋白为目的蛋白。透析法复性蛋白,多粘菌素B去除内毒素后,鲎试剂测定重组蛋白中内毒素分别为0.029EU/mL、0.038EU/mL、0.032EU/mL;BCA法测定纯化复性后重组鞭毛蛋白浓度分别约为:0.48mg/mL、0.27 mg/mL、0.38 mg/mL。(3)重组蛋白FlaB3在一定范围内能以浓度及时间依赖性刺激人巨噬细胞中IL-1β和IL-18转录和表达水平升高。(4)重组鞭毛蛋白FlaB3刺激人巨噬细胞后可激活NLRC4炎症小体,诱导caspase-1的成熟以及IL-1β和IL-18的产生。(5)NLRC4 siRNA转染后能有效抑制NLRC4的表达,并引起caspase-1、IL-1β以及IL-18水平的下调(6)Caspase-1特异性抑制剂VX-765预处理巨噬细胞后,NLRC4表达量无明显减少,而caspase-1、IL-1β以及IL-18表达明显降低。结论:1.成功构建pET28a-Tp0868、pET28a-Tp0792、pET28a-Tp0870表达载体并纯化重组鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3。2.重组蛋白FlaB3可通过激活NLRC4炎症小体,活化caspase-1,诱导人巨噬细胞中促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟与分泌。