力生长因子E肽对体外骨形成与骨吸收的调控机制研究

胰岛素样生长因子I（IGFI）是含有70个氨基酸的单链多肽，为骨基质中含量最丰富的生长因子，对骨代谢有着重要的调节作用。IGFI的E结构域发生选择性剪接产生3种异构体：IGFIEa，IGFIEb（大鼠）和IGFIEc（人类）。其中IGFIEb和IGFIEc一般在肌肉或成骨细胞受到机械刺激或损伤时才得以表达，因此也称作力生长因子（mechano-growth factor，MGF）。分子结构表征发现MGF羧基端E结构域含有24个氨基酸组成的短肽（也称MGF-Ct24E），正是由于MGF-Ct24E才导致MGF功能上与IGFI和IGFIEa不同。MGF自1996年被Goldspink研究团队发现以来，许多研究证实MGF是一种重要的局部组织修复因子。当机体受到机械刺激或组织受损后，MGF得以表达并诱导体内卫星细胞增殖和分化。MGF-Ct24E与MGF功能相似，也具有诱导成肌细胞增殖和神经保护作用，提示MGF-Ct24E一旦从MGF分离出来，其本身固有的生物活性如组织保护、修复和适应等将得以发挥。我们前期研究发现MGF以自分泌或旁分泌的方式积极响应骨细胞（或组织）损伤修复，在兔骨折模型中MGF-Ct24E通过促进成骨细胞增殖和血管新生加速骨折愈合。基于本课题组对MGF-Ct24E的前期研究成果，本研究试图从细胞水平和分子水平探索MGF-Ct24E对骨形成与骨吸收的影响，以便于寻求确切的靶基因和信息通路，为其将来临床应用于骨修复提供可能。本论文主要研究内容和结果如下： （1）MGF-Ct24E对成骨细胞的功能调控及转录组分析： ①通过检测MGF-Ct24E对新生大鼠颅骨成骨细胞增殖、周期、分化及矿化的影响，结果表明MGF-Ct24E促进早期成骨细胞增殖延迟终末分化，促进晚期成骨细胞分化和矿化，最终促进骨形成。 ②利用基因芯片检测MGF-Ct24E对成骨细胞骨形成过程中基因表达的影响，结果表明MGF-Ct24E能有效调节成骨细胞基因的表达，差异表达基因总共2054个，其中上调1179个，下调基因875个；qPCR检测结果显示，所选择的12个差异表达基因（IL1RN、FIGF、CXCL12、ZW10、NOTHCH2、TWIST2、ALPL、IGFBF5、FGFR2、COMP、COL2A1和IGFI）的差异表达情况与基因芯片实验结果基本一致，验证了基因芯片实验结果的可靠性。 ③应用GoSurfer软件和在线软件DAVID对MGF-Ct24E调控成骨细胞差异表达的基因进行GO分析，发现富集指数最高的差异表达基因定位于细胞内部、具有酶结合功能、参与细胞周期进程。Pathway分析发现这些差异表达基因主要参与调控粘着斑通路、细胞周期通路、肌动蛋白细胞骨架调控通路、缝隙连接通路、MAPK信号通路、黏着连接通路和胰岛素信号通路等67个信号通路。 ④对差异表达基因GO生物学过程第3～8层次的节点和Term进行仔细筛选，总共得到95个成骨细胞相关基因。GO生物学过程分析发现，这些基因主要富集的功能分类包括成细胞周期、骨细胞分化负调控、骨化负调控、软骨骨化、骨化调控、骨发育、骨化、骨矿化、血管生成、成骨细胞分化、骨骼系统发育、细胞正在调控、细胞增殖、创伤反应等。Pathway分析发现它们主要参与调控黏着斑、肌动蛋白细胞骨架调控通路、细胞外基质受体作用通路、细胞因子及其受体的相互作用通路、MAPK信号通路、黏着连接通路、TGF-β信号通路、白细胞跨内皮迁移信号通路和Wnt信号通路等多9个通路。 （2）MGF-Ct24E对破骨细胞的功能调控及转录组分析： ①通过检测MGF-Ct24E对破骨细胞增殖、周期、分化以及骨吸收功能的影响，结果显示：MGF-Ct24E不仅抑制破骨前体细胞的增殖，还抑制破骨细胞的形成和分化，且具有浓度依赖性；此外，MGF-Ct24E对破骨细胞的骨吸收功能也存在较为显著的抑制作用。 ②利用基因芯片检测MGF-Ct24E对破骨细胞分化过程中基因表达的调控，结果表明MGF-Ct24E能有效调节破骨细胞基因的表达，差异表达基因总共1712个，其中上调717个，下调895个；qPCR检测结果显示所选择的8差异表达基因（AKT2、SPP1、NF1、ITGB5、NFATc1、TRAF6、MMP9和CTSK）的差异表达情况与基因芯片实验结果基本一致，验证了基因芯片实验结果的可靠性。 ③应用GoSurfer软件和在线软件DAVID对MGF-Ct24E调控破骨细胞差异表达的基因进行GO分析，结果显示富集指数最高的基因定位于细胞内部、具有核苷酸结合功能、参与细胞周期进程。Pathway分析发现MGF-Ct24E调控的差异表达基因主要涉及细胞周期、DNA复制、错配修复、核苷酸切除修复、同源重组、碱基切除修复、嘧啶代谢、TGF-β信号通路、 p53信号通路、硫酸乙酰肝素生物合成、孕激素介导的卵母细胞成熟、戊糖磷酸途径、谷胱甘肽代谢通路、Wnt信号通路、嘌呤代谢通路、卵母细胞减数分裂、血管内皮生长因子信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控和白细胞跨内皮迁移等20个信号通路。 ④对差异表达基因GO生物学过程第3～8层次的节点和Term进行仔细筛选，得到79个与破骨细胞密切相关联的差异表达基因，进一步生物学过程GO分析发现，上调基因主要富集的功能包括细胞分化，器官发育，骨骼发育，骨矿化，骨重塑，成骨细胞分化的；下调基因主要富集的功能包括发育过程，多细胞有机体的发育，系统发育、骨化调控、破骨细胞分化和骨骼发育等。Pathway分析显示这79个基因主要参与调控粘着斑、细胞因子及其受体的相互作用、MAPK信号通路、血管内皮生长因子信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调控、白细胞跨内皮迁移、趋化因子信号转导通路、紧密连接、TGF-β信号通路和Wnt信号通路等10个信号通路。 上述结果提示，MGF-Ct24E通过调控细胞周期进程和调控粘着斑、MAPK信号通路、肌动蛋白细胞骨架调控、TGF-β信号通路、白细胞跨内皮迁移、Wnt信号通路等6条信号通路共同调控体外骨形成和骨吸收。