第一部分小鼠子宫标记滞留细胞的检测
目的:研究小鼠子宫内标记滞留细胞的存在及其分布特点。
方法:选择出生三天的雌性昆明白小乳鼠,实验组乳鼠皮下注射BrdU50ug/g,对照组皮下注射生理盐水100ul,每天2次,共注射3d。于最后一次注射后2h、1w、2w、4w和8w处死并取子宫固定,石蜡包埋用于免疫组化检测,每个时间段5只乳鼠。
结果:实验组标记后2h,小鼠腺体和基质中标记滞留细胞(LRCs)表达最高,分别为45.1%和57.4%,随着时间的增加,LRCs逐渐降低,到第8w在腺体中仅有极少量细胞表达,而基质细胞约有1.5%的LRCs,主要位于血管周围和内膜基层连接处。不同时相腺体和基质细胞中LRCs差异具有显著性(P<0.05)。
结论:昆明白小鼠子宫内LRCs主要位于血管周围和内膜基层连接处等,这些LRCs可能为子宫内膜干细胞。
第二部分体外培养小鼠子宫内膜形成克隆能力的检测
目的:通过体外培养检测小鼠子宫内膜细胞克隆能力。
方法:取出生3d的昆明白雌性小鼠,将其子宫剪碎后用0.125%胰酶消化,计数活细胞,按300个/cm2的密度接种到培养瓶中,培养12d左右。观察细胞及克隆生长特点,并测量细胞克隆大小和计算克隆形成率。同时取成年小鼠子宫培养作为对照。通过组织来源、细胞生长形态、细胞增殖能力以及角蛋白和波型蛋白免疫组化等进行鉴定,并用免疫荧光法检测腺体克隆Ki-67增殖指数。
结果:根据细胞组织来源分有腺体和基质两种克隆,根据细胞克隆大小和生长特点,分大克隆和小克隆两种类型。腺体大克隆和小克隆的大小分别为3.64±1.1和0.53±0.24mm,克隆形成率分别为0.051±0.013%和0.11±0.07%;基质大克隆和小克隆的直径大小分别为2.82±0.5和0.41±0.13mm,克隆形成率分别为0.008±0.001%和0.43±0.03%。四种克隆的克隆形成率均具有显著性差异(P<0.05),腺体和基质大克隆直径大小,腺体和基质小克隆直径大小分别两两比较,差异不均具有显著性(P>0.05),而腺体大小克隆大小比较,基质大小克隆分别两两比较,差异具有均显著性(P<0.05)。成年小鼠子宫有限稀释法原代培养无细胞克隆生长。腺体大克隆Ki-67增殖指数高于腺体小克隆(P<0.05)。
结论:子宫内膜细胞在体外培养中,可以形成单细胞克隆,腺体和基质细胞均可形成大克隆和小克隆。腺体大克隆增殖能力高于小克隆。
第三部分EGF和17β-雌二醇对细胞克隆生长的影响
目的:研究EGF和17β-雌二醇对子宫内膜细胞克隆生长的影响。
方法:在培养基中分别加入10ng/ml的EGF和5×10-8 mol/L的17β-雌二醇,按照第二部分方法对小鼠子宫进行原代培养,观察细胞形态,测量克隆大小并计算细胞克隆形成率,同时用无特殊添加成分的培养基培养作为对照。
结果:与对照组比较,EGF组四种克隆形成率且克隆直径均值略高,但是差异不具有显著性(均P>0.05)。17β-雌二醇组两种小克隆克隆形成率均值略高,而两种大克隆克隆形成率较低,与对照组分别比较差异不具有显著性(均P>0.05)。17β-雌二醇组腺体大克隆大于对照组,差异具有显著性(P<0.05), 17β-雌二醇组与EGF组比较,细胞克隆形成率和大小差异均不具有显著性(P>0.05)。
结论:添加EGF和17β-雌二醇对小鼠子宫在体外培养时,并不能增加其克隆形成率,雌激素在体外有促进腺体克隆细胞分化的作用。
第四部分小鼠间充质干细胞向子宫内膜方向分化的实验研究
目的:探索小鼠骨髓间充质干细胞向子宫内膜的迁移和分化
方法: 1.体外原代培养雄性小鼠骨髓间充质干细胞,并在体外用BrdU体外标记,用CD34和CD29抗体进行免疫组化鉴定,用BrdU抗体检测其标记阳性率。
2.骨髓移植模型:雌性小鼠放疗后,从鼠尾静脉注射移植间充质干细胞,作为放疗后移植组;同时设放疗对照和正常对照组。每组8只小鼠。
3.观察小鼠的一般情况,在小鼠濒死前或者生存>60d后,处死小鼠,取其子宫一侧固定石蜡包埋,用于BrdU免疫组化;另一侧子宫提取DNA,用于PCR检测Sry基因表达。
结果: 1.间充质干细胞呈梭形或多角形,经免疫组化鉴定CD29(+)和CD34(-),符合间充质干细胞特性。Brdu标记阳性率约为80%。
2.骨髓移植模型:放疗对照组在放疗后14d小鼠死亡7/8只;移植组移植后4只存活时间<20d,2只存活时间>30d,2只存活时间>60d。放疗对照组、正常对照组和移植组早期死亡小鼠子宫Brdu检测为阴性。移植组短期存活和长期存活的小鼠,Brdu阳性主要表达在子宫腺体和基质之间的毛细血管内皮细胞及少量基质细胞核内。正常对照组和放疗组小鼠子宫SRY基因检测为阴性。移植组早期死亡、短期存活和长期存活的小鼠子宫SRY基因表达均为阳性。
结论:小鼠间充质干细胞可以迁移到子宫,并有可能成为子宫内膜修复的细胞来源。
