苹果多酚基于GLP-1受体途径降糖作用的机制研究

目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM)是由于胰岛素分泌绝对不足或相对不足,引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱的疾病,初期血糖、尿糖增高,后期病情发展合并一系列的心、肾、眼底的微血管病变和神经病变、感染和结核等。在1型和2型糖尿病中,胰岛β细胞功能障碍都是关键的病理生理过程,其中胰岛β细胞凋亡起着重要作用。目前临床上治疗2型糖尿病多采用化学合成药治疗,这些药物降血糖的作用强、起效快,但是存在不同程度的副作用,如低血糖、肝肾功能损害,而且不能阻止胰岛细胞的凋亡。因此,寻找疗效好、不良反应小的新型降糖药具有极其重要的意义。近年来基于GLP-1受体途径的肠促胰岛素类似物,逐渐进入人们的视野并成为最新研究热点。苹果多酚(apple polyphenols,AP)是苹果中天然存在的一类重要生物活性物质,其中包括:类黄酮类、单宁类、酚酸类及花色苷等。近几年大量研究显示,苹果多酚具有多种活性,如抗氧化、抗肿瘤、抗龋齿等功效。前期实验发现苹果多酚能够调节RIP1-CRE瞬时转染的胰岛β细胞中报告基因GFP的高表达,发挥GLP-1受体激动剂作用。后期选用H2O2诱导胰岛β细胞凋亡,观察苹果多酚对胰岛β细胞是否具有保护作用;通过多次小剂量注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病小鼠模型,并进行苹果多酚预防性给药,来观察和分析苹果多酚对糖尿病小鼠的降血糖作用及其基于GLP-1受体途径的降糖机制。方法:1离体细胞水平1.1 RIP1-CRE瞬时转染法观察苹果多酚对胰岛β细胞中报告基因GFP表达的影响,验证其GLP-1受体激动剂的作用。1.2 MTT法观察苹果多酚对RIN-m5F胰岛β细胞的增殖的影响。1.3免疫荧光法观察苹果多酚对RIN-m5F胰岛β细胞促胰岛素释放的影响。2 MTT法、AO/EB双染色法观察苹果多酚对H2O2作用下RIN-m5F胰岛β细胞活力及凋亡的影响,利用试剂盒测定细胞培养液中MDA及SOD含量,并用western blot法分析细胞中与凋亡密切相关的Akt和Caspase-3蛋白表达的变化,从而明确苹果多酚基于GLP-1受体途径抗凋亡的作用靶点。3整体动物水平:3.1 2型糖尿病小鼠模型的建立:选取性成年ICR小鼠,多次小剂量腹腔注射STZ建立糖尿病小鼠模型。3.2观察记录苹果多酚预防性给药对糖尿病ICR小鼠的体重、摄食量、饮水量、尿量等生理代谢指标的影响。3.3测定苹果多酚预防性给药对糖尿病ICR小鼠禁食血糖和非禁食血糖、血脂等生化指标的影响。3.4观察苹果多酚预防性给药对糖尿病ICR小鼠的胰腺系数的影响。3.5通过HE染色进行胰腺组织形态学观察。3.6用胰岛素免疫组化分析观察苹果多酚对胰腺的细胞数量,胰腺质量和其组织构造的影响,从而评价苹果多酚对胰岛β细胞的保护调节作用。3.7利用Western Blot检测GLP-1受体下游重要分子PDX-1的表达量,从而确定苹果多酚基于GLP-1受体途径对胰岛β细胞的保护作用机制。3.8半固体糊法观察苹果多酚对糖尿病小鼠肠推进和胃排空的影响。结果:1离体细胞水平:1.1苹果多酚能够调节RIP1-CRE瞬时转染的胰岛β细胞中报告基因GFP的高表达,发挥GLP-1受体激动剂作用。1.2 MTT比色法结果显示,AP给药组细胞活力明显增加(P<0.01),且呈现一定的浓度依赖性。1.3免疫荧光结果显示,AP给药组胰岛素阳性结果增加(P<0.05)。1.4 H2O2诱导下,细胞活力显著降低(P<0.01),AP给药组较阴性对照组,能较好地改善细胞存活度(P<0.01),且呈一定的浓度依赖性。AO/EB染色法发现AP组较阴性对照组,细胞形态更加完好,凋亡明显建少。AP还能增强细胞抗氧化能力(P<0.05)。Western blot分析发现,较阴性对照组,AP组能增强Akt的表达(P<0.05),降低Caspase-3(P<0.05)的表达。2整体动物水平:2.1各组体重、饮水量、摄食量、尿量比较:模型组小鼠体重较正常组有所下降(P<0.05),饮水量、摄食量、垫料湿度明显增加,而AP给药组较模型组,体重变化无显著性差异,但是更很好地降低饮水量、摄食量,改善垫料湿度。2.2各组禁食和非禁食血糖、血脂比较:模型组小鼠禁食及非禁食血糖、血脂较空白组显著升高(P<0.05),AP组更显著降低糖尿病小鼠禁食和非禁食血糖(P<0.05),但是对血中甘油三酯、总胆固醇含量无明显影响。2.3各组胰腺系数比较:模型组小鼠较空白组胰腺系数明显增大(P<0.05),AP预防性给药组较模型组胰腺系数显著降低(P<0.05)。2.4组织形态学观察:一般病理学观察,发现同糖尿病模型对照组相比,苹果多酚给药组糖尿病小鼠胰岛数量明显增加,但仍明显少于正常对照组小鼠。同糖尿病模型对照组小鼠比较,胰岛内细胞数量有所增加,核固缩和胞浆空泡化减轻。2.5胰岛素免疫组化分析:与正常组小鼠相比,糖尿病小鼠胰岛素阳性表达面积减少,胰岛β细胞数目减少,而苹果多酚能增加阳性表达、胰岛β细胞数目(P<0.05)。2.6 PDX-1表达量比较:与正常组小鼠相比,糖尿病小鼠胰腺组织中PDX-1表达量明显下降(P<0.05),而苹果多酚给药组胰腺组织中PDX-1表达量显著增强(P<0.05)。2.7胃排空及肠推进:与对照组相比,苹果多酚能减缓糖尿病小鼠的胃排空(P<0.05)。结论:苹果多酚能调节RIP1-CRE瞬时转染的胰岛β细胞中报告基因GFP的高表达,发挥GLP-1受体激动剂作用。苹果多酚还对RIN-m5F胰岛β细胞具有促增值、促分泌作用,并且对H2O2诱导的胰岛β细胞凋亡具有保护作用,增强细胞抗氧化能力,其机制可能与Akt表达上调,Caspase-3表达下调有关。苹果多酚预防性给药可以改善多次小剂量注射STZ诱导的糖尿病ICR小鼠模型的非禁食血糖和禁食血糖水平,改善糖尿病ICR小鼠“三多一少”的症状,减缓胃排空,促进糖尿病ICR小鼠胰岛素的分泌,增强对胰岛素的敏感性,保护胰岛β细胞,减少胰腺组织的损伤,使PDX-1蛋白表达上调,从而明确了苹果多酚基于GLP-1受体途径对胰岛β具有保护作用。为新型抗糖尿病药物、降糖保健品的开发提供了新的靶点和研究方向。