基于体内自组装胶束形成机制的羊脂油对淫羊藿黄酮苷元抗骨质疏松增效机理研究

本文较全面地查阅了淫羊藿抗骨质疏松药效物质基础相关报道,总结淫羊藿中的多种活性黄酮的抗骨质疏松作用及其作用强度。结合我们实验室十多年的研究基础,基于淫羊藿活性黄酮的体内代谢,阐述了淫羊藿抗骨质疏松的药效物质基础并非某一种黄酮化合物,即不仅有活性最强但吸收差较的淫羊藿黄酮苷元,又有活性较强且吸收较好的淫羊藿黄酮次糖苷。羊脂油(SO)炙淫羊藿,是一种传统的炮制技术,能增强淫羊藿的温肾助阳作用,起到增强淫羊藿抗骨质疏松作用。既然,淫羊藿黄酮苷元具有很强的抗骨质疏松活性,我们就结合SO炮制工艺,基于体内自组装胶束形成机制考察淫羊藿炮制辅料SO对淫羊藿黄酮苷元(CIT、IT)的抗骨质疏松增效机制。1.SO增强了淫羊藿黄酮苷元抗骨质疏松作用,但其自身没有抗骨质疏松作用摘除雌性大鼠双侧卵巢,造骨质疏松模型,每周记录大鼠体重变化,最后一次给药后,对大鼠眼眶取血,检测大鼠血清中的血清羟脯氨酸(HOP)和碱性磷酸酶(AKP)、骨保护素(OPG)、骨钙素(OCN)、核因子κB受体活化因子配基(RANKL)、抗酒石酸盐酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)。随后,分别取出子宫、胫骨和股骨,并记录股骨和子宫重量,右侧股骨先检测骨密度(BMD),再进行3D-μCT扫描,最后进行免疫印迹实验(western blot)。左侧股骨进行基因和蛋白表达实时定量(RT-PCR)。右侧胫骨进行三点弯曲实验,考察生物力学性质。左侧胫骨进行免疫组化实验,考察相关因子的表达。研究发现,CIT、IT均具有较好的抗骨质疏松作用,加入SO后,能增强CIT、IT的抗骨质疏松作用,但是SO本身未体现出抗骨质疏松作用。因此,我们推测SO的增效作用可能是其具有促进CIT、IT的吸收而发挥增效作用。2.抗骨质疏松黄酮苷元的体内吸收、分布、代谢和排泄(ADME)过程的初步研究CIT、IT均具有一定的抗骨质疏松作用,为了后续研发,我们采用高分辨率质谱,分析了CIT、IT在大鼠体内的代谢产物及其代谢途径。结果,鉴定出了CIT的59个代谢产物,其中在血浆、胆汁、尿液、粪便中分别有23、13、17、6个代谢产物；鉴定出了IT的43个代谢产物,其中在血浆、胆汁、粪便中分别有12、14、17个代谢产物。CIT和IT在大鼠体内均产生了大量的代谢产物,葡萄糖醛酸化和硫酸酯化是他们共同的代谢过程。黄酮或异黄酮结构上羟基,是葡萄糖醛酸化和硫酸酯化的主要位点,羟基数量越多可能增加他们的结合亲和力,也可能影响到药物在体内的代谢速度和药理作用的差别。在化学结构上,IT具有3个酚羟基(C-3,C-5和C-7),而CIT有2个酚羟基(C-3,C-5)。由于这种差别的存在,CIT与IT也必将存在不同的药理作用和药效强度。3.SO的增效作用是其能促进淫羊藿黄酮苷元的吸收,而发挥增效作用如果SO能促进淫羊藿活性苷元(CIT、IT)的吸收,那么在SO的作用下,淫羊藿活性苷元(CIT、IT)的相对生物利用度应有显著提高。因此,紧接着采用血药浓度法,监测羊脂油作用下的CIT、IT的血药浓度,并绘制大鼠口服后的浓度-时间变化曲线,计算药动学参数,并评价SO对CIT、IT生物利用度的影响。加入SO组的CIT、IT的Cmax和AUC较单一的CIT、IT组均有显著增加,SO的加入提高了CIT、IT的生物利用度。4.SO的促吸收作用是其所含大量的具有表面活性剂样作用的脂肪酸类成分SO是来源于牛科动物绵羊Ovis aries linnaeus或山羊Capra hircus linnaeus的脂肪油,含有丰富的无机元素和脂肪酸,这些丰富的脂肪酸均具有脂肪长链以及表面活性,这就与我们的前期研究相吻合。因此,我们采用GC-qMS分析联用技术以及专业数据库,全面分析了SO中脂肪酸组成,最终鉴定出了其中25种脂肪酸,并建立了同时测定SO中10种主要脂肪酸的分析方法。结果发现,硬脂酸、棕榈酸、油酸是SO中的主要脂肪酸类成分。此外,我们还采用ICP-MS分析技术,建立了同时测定SO中14种无机元素含量的方法。这些工作对阐述SO中的化学组成,建立炮制辅料SO的质量标准,具有重要意义。5.SO中的脂肪酸类成分与机体分的泌胆酸盐类成分共同作用,在体内自组装成纳米混合胶束,并作为黄酮苷元的载体,而促进苷元的吸收,体现增效作用SO中的脂肪酸在化学结构上同时存在亲水基和疏水基,即可能具有一定的表面活性及表面活性剂样作用。再加上正常机体能分泌胆汁中的胆汁酸及其盐类也是一种生物表面活性剂。当CIT或IT与SO一同口服进入体内后,在SO自身富含的脂肪酸类成分及机体内胆酸盐的共同作用下,可自组装形成一种混合纳米胶束,并作为CIT或者1T的载体,而改善CIT或者IT的吸收,最终体现出增效作用。我们通过体外模拟,也证实了我们的假说：在SO与胆酸盐的共同作用下,脂肪酸类成分与胆酸盐能自组装形成混合胶束,这种混合胶束能形成粒径较小、粒子更稳定的自组装胶束。大鼠在体肠灌流实验表明,SO作用下与CIT、IT自组装形成胶束后,改善了CIT、IT的渗透系数,促进了CIT、IT的肠吸收。综上所述,SO之所以能够增强淫羊藿黄酮苷元的抗骨质疏松作用,是由于SO中含有大量的具有表面活性剂样作用的脂肪酸类成分(硬脂酸、棕榈酸、油酸),能与体内的胆酸盐类成分在体内自组装成胶束,并作为苷元的载体,促进苷元的在体肠吸收而增效。