胃癌微转移检测的基础与临床研究

目的：胃癌的发病率和死亡率在我国居各种恶性肿瘤之首。临床工作中，尽管大多数的胃癌患者手术时能够做到根治性切除，但手术后仍有70～80％的患者于五年之内死亡。其中手术时甚至手术前就已经存在于淋巴结、外周血及骨髓中的潜在的微小转移灶以及播散的肿瘤细胞是复发和转移的主要原因，因此，若能有一种方法在手术前或手术后近期内对这些微小转移灶进行及时的检测和有效的治疗，必将使我们对胃癌的诊断和治疗理念发生巨大的变化，而且，通过对这些微转移灶的检测，还可以监控全身治疗的效果，为患者治疗方案的选择提供理论依据，从而真正实现个体化治疗。近年来，分子生物学、细胞生物学、免疫学等相邻学科及其研究方法的不断发展，使得我们从大量的正常细胞中检测极微量、仍至单个肿瘤细胞成为可能。相应的，国内外许多学者已经开始应用免疫细胞化学法、FCM和PCR等新兴的研究方法来进行肿瘤微转移灶的检测。通过大量的研究，我们目前已经对胃癌的发病机制有了许多新的认识，如很多胃癌患者在发病初期就存在局部仍至全身的微转移灶，而到了后期，大多数的患者在外周血及骨髓中均广泛存在着肿瘤细胞。患者骨髓中存在肿瘤细胞与预后直接相关等。但目前国内外的报告中对胃癌微转移的研究均缺乏系统性，有的选择病例不恰当，有的研究技术不先进，有的研究方法单一，缺少不同方法的相互印证，因而所得结果差别很大。为了进一步明确胃癌中淋巴结、外周血及骨髓中可能存在的微转移灶情况，及其与患者临床病理参数及预后的关系，本课题应用免疫组织化学法、RT-PCR、免疫荧光FCM、免疫荧光法及MACS微型免疫磁珠富集法对胃癌患者的淋巴结、外周血及骨髓的微转移情况进行了系统的研究，并与各种临床病理参数进行了比较；而后对MACS微型磁珠富集的骨髓微转移肿瘤细胞进行了形态学研究，培养及免疫组化研究，试图发现胃癌中微转移灶的发病规律，并对胃癌微转移的临床应用价值作进一步的评价。 方法 1. 选取1991年4月至1994年4月行手术切除的常规病理检测无淋 巴结转移的胃癌病例44例，收集其淋巴结蜡块共466个，分别以鼠抗人CK20抗体，鼠抗人EMA单克隆抗体，鼠抗人CA72-4单克隆抗体进行免疫组化SP法染色，显微镜下根据染色结果确定其微转移情况，然后与各病例的临床病理及随访资料进行比较。 2. 选取2002年12月至2003年6月行手术治疗的胃癌患者49例，胃良性病变患者5例及健康志愿5例，采用RT-PCR技术，以β2MG基因为内参照，同时对其骨髓与外周血中的CK20 mRNA表达进行检测，然后与各临床病理参数进行比较。同时以掺有OCUM-2M细胞株的骨髓细胞模型进行灵敏度试验，以探讨RT-PCR方法检测胃癌骨髓微转移的敏感性及特异性。 3. 以胃良性病患者骨髓有核细胞与OCUM-2MD3细胞株细胞以10种不同比例混合，使其中肿瘤细胞的频数自0～5×10-5，作为骨髓微转移肿瘤细胞模型。然后以结合有CK7/8抗体的MACS微型免疫磁珠进行两次肿瘤细胞富集。在富集前后分别进行免疫荧光FCM分析和免疫荧光检测，得出每个样本的肿瘤细胞及骨髓细胞个数。免疫荧光FCM分析以CK-FITC标记肿瘤细胞，以CD45-PerCP标记正常骨髓细胞；免疫荧光检测时，以CK-FITC标记肿瘤细胞，以DAPI和EB标记所有细胞的细胞核。根据所得数据计算出MACS的富集倍数及回收率，并比较FCM分析和免疫荧光检测方法的检测效率。 4. 选取2002年12月至2003年6月行手术治疗的胃癌患者35例，胃良性病变患者5例及健康志愿者5例，提取其骨髓有核细胞，以结合有CK7/8抗体的MACS微型免疫磁珠进行两次微转移肿瘤细胞富集。于富集前后，分别进行免疫荧光FCM分析，以确定骨髓中的肿瘤细胞数。分析时，以CK-FITC标记肿瘤细胞，以CD45-PerCP标记骨髓细胞。将分析结果与各临床病理参数及本课题第二部分的RT-PCR结果进行比较。 5. 另选2003年4月至2003年7月手术的胃癌患者20例，提取骨髓有核细胞后，以结合有HEA抗体的MACS微型免疫磁珠进行活性肿瘤细胞分选两次，分选后先以CK-FITC标记肿瘤细胞，以DAPI和EB标记所有细胞的细胞核，进行免疫荧光染色研究。然后选取其中有微转移细胞的富集后肿瘤样本进行细胞培养和双染法免疫组化研究，免疫组化法研究所用抗体为CK20、PCNA和P53抗体，最后分析这些微转移细胞的形态特 点，细胞活性及免疫表型。 结果 1. 44例胃癌病例的466个淋巴结中，有18例（40.9%）患者的51个淋巴结（10.9%）发现微转移灶，微转移淋巴结数目最少者为1个，最多者为7个；其中转移淋巴结数<3个者9例，≥3个者9例。淋巴结的微转移与患者的性别（P=1.000，χ2=0.168，卡方检验）、年龄（P=0.912，χ2=0.012，卡方检验）、肿瘤部位(P=0.511，χ2=1.342，卡方检验)、组织类型(P=0.075，χ2=3.175，卡方检验)及TNM分期(P=0.301，r=0.160，Spearman相关分析)均无关。用三种抗体进行免疫组化染色后，所发现的微转移淋巴结并不完全一致，其中CK20 40个（8.6%），CA72-4 27个（5.8%），EMA 21个（4.5%）。随访资料显示，有微转移的病例5年存活率为61.11±11.49%，无微转移的病例为92.31±5.23%，二者相比有统计学意义（P=0.0113，χ2=6.42，log-rank检验）。转移