三七总皂苷对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑β淀粉样蛋白代谢通路影响的研究

阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)又称老年性痴呆,是老年期的一种常见性疾病,其典型特征性的神经病理改变是脑组织细胞外神经炎性斑块(senile plaques, SP)和细胞内神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangle, NFT)。淀粉样蛋白(Ap)是SP的主要成份,由淀粉样肽前体蛋白(P amyloid protein precursor,APP)先后经p-分泌酶和γ-分泌酶水解产生,但绝大多数的APP在a-分泌酶作用下通过非淀粉源途径代谢释放可溶性的sAPPa而阻止Ap的生成。另外,APP基因5'端调控区存在转录因子NF-κB结合位点(APPκB位点),由NF-κB家族成员P50参入构成的复合物可与APPκB结合位点特异结合而激活APP的转录。抑制APP的生成和减少Aβ沉积是防治AD的关键,故影响APP基因表达的转录因子和APP代谢为Aβ的分泌酶是治疗AD的潜力靶点。 三七总皂苷(Panax notoginseng saponins, PNS)是中药三七的主要活性成分,前期研究已证实PNS对老年性痴呆模型大鼠空间学习记忆损害具有明显改善作用,可抑制快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑内APP和Aβ1-40、Aβ1-42的表达,但PNS抑制快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑内p淀粉样蛋白及其前体蛋白表达的作用机理是仍不清楚。 目的：本课题将以快速老化痴呆模型小鼠SAMP8为动物模型,观察PNS对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑中直接影响APP生成量的NF-κB转录因子和影响APP分解代谢为Ap相关分泌酶水平,弄清PNS影响Ap代谢途径的部位和环节,阐明PNS抑制Ap及其前体蛋白表达的作用机制,为开发PNS治疗老年性痴呆提供更多的科学依椐。 方法： 1.将快速老化痴呆模型小鼠SAMP8随机分为对照组、PNS高剂量组(200mg·kg-1)、低剂量组(100mg·kg-1)、石杉碱甲组(0.03mg·kg-1),每组15只,另留10只(模型组)在给药前进行检测记忆和行为检测,以检验SAMP8模型是否成功。PNS和石杉碱甲均以双蒸水调配后灌胃给药,对照组给予药物组相同容积的双蒸水。每天灌胃1次,连续给药2个月。 2.利用Morris水迷宫方法和病理组织检查联合检测PNS对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8学习记忆能力影响和海马神经元损伤。 3.采用实时荧光定量PCR技术对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑中NF-κB转录因子P50、α-分泌酶ADAM (ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PSl和PS2mRNA进行定量分析,了解上述基因的表达差异。 4.采用直接荧光法和ELISA法检测快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶的活性。 5.采用免疫组化和Western blot方法检测快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑NF-κB转录因子P50,α-分泌酶ADAM (ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PSl和PS2蛋白的表达水平。 6.采用HE染色法观察快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑小胶质细胞的活动状态。 7.采用ELISA法检测快速老化痴呆模型小鼠SAMP8血清炎症因子IL-1p的含量变化。结果： 第一章PNS对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8学习记忆行为的影响 1. Morris水迷宫测试结果显示,在定位航行实验训练中,与药物对照组相比,PNS组SAMP8的逃避潜伏期明显缩短,寻求次数增多,停留时间延长,平台象限百分比增大(P<0.01或P<0.05),5d变化趋势图显示给药组的逃避潜伏期、寻求次数、停留时间和平台象限百分比变化幅度明显,而药物对照组变化缓和；空间探索实验亦显示PNS组SAMP8的原平台象限百分比、跨越原平台次数、停留时间都比药物对照组有所改善,说明PNS对SAMP8的学习记忆行为能力有改善作用,且随着训练时间的延长,PNS对SAMP8学习记忆能力的改善作用越明显。模型组在各项指标中均比对照组强,说明随着年龄的增加,SAMP8的学习记忆能力有所下降,表明SAMP8模型是成功的。 2.病理组织学检验结果显示药物对照组SAMP8海马结构异常,神经元细胞明显减少,锥体细胞带紊乱、变稀、中断,同时可见许多细胞体积缩小,胞核固缩,染色加深；PNS组SAMP8的皮质和海马形态均有不同程度的恢复,神经元数量增多,细胞排列整齐,结构致密,形态较正常,分布比较均匀,胞内结构和染色正常,表明PNS可减轻快速老化痴呆模型小鼠SAMP8海马神经元损伤。 第二章PNS减少快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑APP转录的机制研究 1.HE染色显示对照组SAMP8的小胶质细胞胞体增大,染色深而不匀,胞体呈圆形无突起,成为激活型小胶质细胞,PNS处理的SAMP8海马区有散在未激活小胶质细胞,染色浅而均匀,突触细长,呈分支状,周围神经细胞正常。 2. ELISA法检测结果得知药物干预SAMP8后,PNS(200mg·kg-1)能显著降低SAMP8血清IL-1β的含量(P<0.01),提示PNS能减少快速老化痴呆模型小鼠SAMP8血清中炎症因子IL-1β的释放。 3.由Real-time PCR结果可知,与对照组相比,PNS(200mg-kg"1)能降低SAMP8大脑NF-κB转录因子p50mRNA的含量(P<0.05),提示PNS能下调快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑NF-κB转录因子p50mRNA的水平。 4. Westblot法和免疫组化法结果显示,与对照组比较,PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)明显降低SAMP8大脑NF-κB转录因子p50蛋白相对灰度和免疫阳性细胞数(P<0.01),提示PNS能下调快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑(?)NF-κB转录因子p50蛋白的表达。 第三章PNS对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑β淀粉样蛋白代谢路径相关分泌酶的影响 1.直接荧光法结果显示,α-分泌酶在样品蛋白浓度为2mg·mL-1时,药物组的RFU值均比对照组高(P<0.01),β-分泌酶在样品蛋白浓度为3mg·mL-1时,PNS组的RFU·μg-1值比对照组低(P<0.01),提示PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)可上调SAMP8大脑α-分泌酶的活性,而降低β-分泌酶的活性;ELISA检测证明PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)对SAMP8大脑γ-分泌酶的活性无显著影响(P>0.05)。 2. Real-time PCR检测PNS对SAMP8大脑组织中α-分泌酶ADAM (ADAM10、 ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PS1和PS2mRNA表达的影响。 ①PNS (200mg·kg-1)能上调SAMP8大脑(?)ADAM9mRNA的表达(P<0.01)；PNS(100mg·kg-1)可降低SAMP8大脑ADAM10和ADAM17mRNA的表达,但PNS(200mg-kg-1)对(?)ADAM10和(?)ADAM17mRNA的表达无明显影响(P>0.05)。 ②PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能显著降低SAMP8脑内BACE1mRNA的表达(P<0.01)。 ③PNS能显著降低SAMP8脑内Aph-1mRNA的含量(P<0.05),但对PSl和PS2mRNA的表达无明显影响(P>0.05)。 3.免疫印迹和免疫组化技术检测PNS对SAMP8大脑组织中a-分泌酶ADAM(ADAM10、ADAM17和ADAM9)、β-分泌酶BACE1、γ-分泌酶Aph-1和早老素PS1和PS2蛋白表达的影响。 ①PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)可上调SAMP8大脑ADAM9的蛋白表达而下调ADAM10的蛋白表达(P<0.01), PNS (200mg·kg-1)还可下调ADAM17蛋白表达(P<0.05)。 ②PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能降低SAMP8脑内BACE1蛋白的表达(P<0.01)。 ③PNS (200mg·kg-1,100mg·kg-1)能显著降低SAMP8脑内Aph-1蛋白含量(P<0.01或P<0.05),对PS2蛋白则是上调作用(P<0.01),但对PS1蛋白的作用不明显(P>0.05)。 结论： 1.PNS对快速老化痴呆模型小鼠SAMP8的学习记忆行为能力有改善作用,且随着训练时间的延长,PNS对SAMP8学习记忆能力的改善作用越明显。 2.PNS可减轻快速老化痴呆模型小鼠SAMP8海马神经元损伤。 3.PNS可降低SAMP8大脑激活的小胶质细胞数目,引起炎症因子IL-1β的释放减少,从而减轻APPκB结合位点活性的刺激；此外,减少的IL-1β可降低转录因子p50的表达,从而降低其与轻APPκB结合位点活性的结合,最终导致APP基因转录减少。 4.PNS能从基因水平上上调快速老化痴呆模型小鼠SAMP8大脑ADAM9mRNA的表达,从而提高ADAM9蛋白表达,α-分泌酶的活性的升高可能由ADAM9上调所致。 5.PNS从基因和蛋白水平上下调快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑内BACE1的水平,从而降低β-分泌酶的活性。 6.PNS能在基因和蛋白水平下调快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑内Aph-1表达,上调PS2蛋白表达,对PSl蛋白表达无显著影响,但PNS对Y-分泌酶活性无明显影响可能是由于PNS对Aph-1、PS1和PS2综合作用的结果。 本课题研究结果表明PNS既可以下调快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑内NF-κB转录因子P50的表达从而减少APP的生成,亦通过升高快速老化痴呆模型小鼠SAMP8脑内α-分泌酶的活性,降低β-分泌酶活性而减少APP代谢为Aβ。