羧甲基茯苓多糖对在两种肝癌细胞上清液中培养的树突状细胞的成熟及免疫功能影响

目的本实验旨在研究有HBV存在的肝癌细胞上清的培养环境对树突状细胞（Dendriticcell,DC）成熟和免疫功能的影响,并进一步研究羧甲基茯苓多糖（CMP）对不同诱导环境中培养的DC的影响及与NF-κB/Rel信号通路的关系。通过本研究,有望为今后乙肝相关性肝癌的中医药免疫及生物辅助治疗提供研究思路及客观依据。 方法无菌条件下常规采集脐血,肝素抗凝,采用密度梯度离心的方法获得脐血单个核细胞,用含10%胎牛血清（Fatal calf serum,FCS）的RPM1-1640完全培养基在25ml培养瓶贴壁培养2.5小时,去除悬浮的淋巴细胞后,分别予含rhGM-CSF、rhIL-4（作用浓度分别是50ng/ml、50ng/ml）的完全培养基进行培养;培养收集两种肝癌细胞株（HepG2,HepG2.2.15）培养上清液,按体积比V上清:VRPMI-1640不完全培养基=1:3制备条件培养基（conditionmedium,CM）;羧甲基茯苓多糖（carboxymethylpachymaran,CMP）用不完全RPMI-1640溶解。第一部分（共分为3组）:空白对照组:不加任何CM,只加与实验组等量的不完全RPMI-1640培养基作为对照;实验组:每组分别于培养第3天换成CMHepG2或CMHepG2.2.15;第二部分（分为两个阶段）:第一阶段（分为4组）:空白对照组;实验组:每组各加入浓度为50μg/ml、150μg/ml、300μg/ml的CMP;MTT法确定CMP最佳作用浓度;第二阶段（共分为6组）:正常对照组;实验组（2组）:CM(CMHepG2,CMHepG2.2.15)加CMP组;阴性对照组（2组）:不加CMP只加CM(CMHepG2.2.15,CMHepG2)组和单纯CMP组;联合培养7天后,于第8天加入rhTNF-α20ng/ml,倒置相差显微镜观察各组细胞形态,流式细胞术检测第14天细胞特异性表面分子标志CD83、CD86、HLA-DR、CD1a的表达。采用MTT法检测MLR;收集各组DCs培养上清和MLR上清,采用ELISA检测IL-12p70以及IFN-γ的分泌;收集各组细胞,抽提核蛋白,ELISA定量法检测NF-κB的活性。 结果 1.两种肝癌细胞上清液制备的培养基培养的DCs的形态、刺激淋巴细胞增殖能力、IL-12分泌水平和DC的表面分子标志（CD1a、CD83、CD86、HLA-DR）均显著低于正常培养条件下的DCs,差异显著（p＜0.01）,有统计学意义。 2.在有HBV存在的肝癌细胞上清液制备的条件培养基中培养的DCs的形态、刺激淋巴细胞增殖能力、IL-12分泌水平和DC的表面分子标志（CD1a、CD83、CD86、HLA-DR）均显著低于无HBV,存在的肝癌细胞上清液制备的条件培养基中培养的DCs,差异有统计学意义（p＜0.05）。 3.正常培养环境中加入CMP（150μg/ml）后,DC表面分子标志（CD1a、CD83、CD86、HLA-DR）高表达,体外刺激淋巴细胞增殖的能力较未加入CMP的正常组升高,差异有统计学意义（p＜0.05）;DC培养上清液中IL-12及MLR上清液中IFN-γ水平升高,差异有统计学意义（p＜0.05）;经CMP处理后,CM环境中培养的DC表面分子标志（CD1a、CD83、CD86、HLA-DR）较各单纯CM组表达略高,差异有统计学意义（p＜0.05）;体外刺激淋巴细胞增殖的能力、DC培养上清液中IL-12及MLR上清液中IFN-γ水平均分别较各单纯CM组高,差异有统计学意义（p＜0.05）。 4.与正常组相比,单纯CMP组DC胞核内NF-κB的表达升高,差异有统计学意义（p＜0.05）;与正常对照组相比,两种CM诱导组DC胞核内NF-κB的表达降低,差异有统计学意义（p＜0.05）;而加入CMP的CM组DC胞核内NF-κB表达较未加入CMP的CM诱导培养组有所升高,但差异无统计学意义（p＞0.05）。 结论 1.两种肝癌细胞上清液可抑制DC的成熟和免疫功能;HBV的存在可进一步抑制DC的免疫功能,这也许可以解释临床乙肝相关性肝癌为何较肝细胞肝癌难治。 2.两种肝癌细胞上清液中培养的DC的免疫功能受到抑制,这可能与DC核内的NF-κB/Rel信号通路的抑制有关。 3.羧甲基茯苓多糖（CMP）可上调正常脐血来源DC以及肝癌细胞培养上清中受到抑制的DC的免疫功能,且这种作用可能与NF-κB/Rel信号通路的活化有关。具体机制还有待进一步研究与验证。