同型半胱氨酸对BMSCs分化功能的影响及白藜芦醇、葛根素的干预作用

目的:观察同型半胱氨酸(Hcy)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨及成脂分化功能的影响,及白藜芦醇、葛根素干预后细胞成骨成脂分化功能的变化,探讨同型半胱氨酸致骨质疏松及白藜芦醇及葛根素抗骨质疏松的作用机制。方法:1.全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs,P3代BMSCs经流式细胞仪检测细胞表面标志物CD34、CD44、CD45、CD90的表达。2.MTT法检测细胞活性,筛选合适的同型半胱氨酸、白藜芦醇及葛根素干预浓度。3.将生长状态良好的P3代BMSCs分为:正常对照组、OM或AM组(成骨或成脂诱导)、R或P组(10μmol/L白藜芦醇或葛根素)、H组(100μmol/L Hcy)、R+H或P+H组(10μmol/L白藜芦醇或葛根素+100μmol/L Hcy)、R+H+L或P+H+L组(10μmol/L白藜芦醇或葛根素+100μmol/L Hcy+10μmol/L LY294002)。通过茜素红及油红O染色后钙结节及阳性细胞数的变化,实时荧光定量PCR检测成骨分化调控基因Runx2,成骨标志基因BMP2、OPG、Collagen?及成脂分化调控基因PPAR-γ表达,试剂盒检测ALP水平评估细胞成骨及成脂分化功能。4.流式细胞仪检测ROS,试剂盒检测MDA、SOD、GSH-PX评估细胞氧化应激水平。5.WB检测各组细胞AKT、p-AKT及Fox O1蛋白表达变化。结果:1.SD大鼠骨髓间充质干细胞分离培养及鉴定:SD大鼠的股骨及胫骨骨髓中成功分离出梭形的BMSCs,流式细胞仪检测可见P3代大鼠BMSCs表达CD44(99.86±5.934)%及CD90(95.10±2.013)%,不表达CD34(0.68±0.612)%及CD45(0.31±0.117)%。2.MTT结果示:1～1000μmol/L的Hcy对BMSCs增殖呈浓度依赖性抑制(p<0.05),0.1μmol/L的Hcy则促进BMSCs增殖(p<0.05)。0.1～100μmol/L白藜芦醇可以促进BMSCs增殖,以10μmol/L的浓度作用最佳(p<0.05),10～100μmol/L葛根素可以促进BMSCs增殖(p<0.05),而白藜芦醇及葛根素均可以减弱Hcy对BMSCs增殖的抑制作用(p<0.05)。3.茜素红、油红O染色及PCR结果示:成骨诱导后茜素红染色可见Hcy干预后细胞钙结节形成明显减少,Runx2、BMP2、Collagen?及OPG表达下调,ALP活性下降(p<0.05),PPAR-γ表达增高(p<0.05),成脂诱导后油红O染色可见H组阳性细胞百分比高。与H组比较R+H组及P+H组Runx2、BMP2、Collagen?及OPG表达增高(p<0.05),ALP活性升高(p<0.05),PPAR-γ表达下降(p<0.05)。PI3K/AKT信号通路抑制剂LY294002干预后,白藜芦醇及葛根素对Hcy抑制成骨相关基因促进成脂相关基因表达的作用被部分阻断(p<0.05)。4.氧化应激指标检测结果示:Hcy干预后细胞氧化应激指标ROS及MDA增高,抗氧化剂SOD及GSH-PX活性降低(p<0.05),Gadd45表达增加(p<0.05),白藜芦醇及葛根素可以使Hcy干预细胞ROS、MDA水平降低而SOD、GSH-PX水平升高(p<0.05),Gadd45表达下降(p<0.05),但白藜芦醇及葛根素对Hcy的干预作用可以被LY294002部分阻断(p<0.05)。5.WB结果示:成骨诱导分化后细胞p-AKT/AKT表达升高(p<0.05),与正常对照组比较Hcy干预可以使p-AKT/AKT及Fox O1表达减少(p<0.05),白藜芦醇及葛根素干预后可以减弱Hcy对p-AKT/AKT及Fox O1表达的抑制,而这种干预作用可以被LY94002部分阻断(p<0.05)。结论:同型半胱氨酸可以通过诱导细胞氧化应激,进一步抑制大鼠BMSCs成骨分化促进其成脂分化。而白藜芦醇及葛根素具有抗骨质疏松的作用,其机制可能是:白藜芦醇及葛根素通过激活PI3K/AKT/Fox O1信号通路发挥抗氧化应激作用,进而促进大鼠BMSCs成骨分化功能抑制其成脂分化功能。