猪脂联素基因的染色体定位、克隆、原核表达、抗血清制备及体内表达调控研究

脂联素是由脂肪组织特异表达的细胞因子，分泌后进入血液循环，调节体内能量代谢。脂联素球状区在体内独立存在，与脂联素功能相似。虽然由脂肪组织特异表达，但是当动物脂肪过度沉积时脂联素表达及血液脂联素水平反而下降。另外，2型糖尿病、一些心血管疾病患者中的血液脂联素水平很低，而增加体内脂联素有助于这些疾病的改善。研究证实脂联素能增强胰岛素敏感性并有一定的抗炎症功能。 本文以猪为研究对象，旨在建立猪体内脂联素表达量的检测方法。首先用RT-PCR扩增脂联素编码区和球状区，构建pGEX-Adiponectin和pGEX-gAdiponectin表达载体，转化到BL21(DE3)中进行表达，得到猪脂联素GST融合蛋白及脂联素球状区GST融合蛋白。然后用重组蛋白免疫新西兰白兔而产生兔抗猪抗血清。其次建立了半定量PCR方法研究瘦肉型和脂肪型猪脂联素表达差异。半定量PCR要求PCR扩增在指数期进行，所以先要摸索指数期循环数，发现在25～29个循环脂联素和β-actin均处于指数期。以27为最终循环数进行半定量PCR，结果显示瘦肉型猪的表达量高于脂肪型。第三建立了竞争性PCR方法对长白猪脂联素mRNA进行绝对定量。用限制性内切酶Ava Ⅰ处理脂联素编码区，回收N端267bp和C端372bp片段，连接，然后进行PCR扩增，从而得到竞争性模板。对竞争性模板进行稀释，与猪脂联素cDNA进行竞争性PCR反应，通过分析PCR产物计算出长白猪脂肪组织中脂联素mRNA的含量。最后应用辐射杂种细胞系技术将猪脂联素定位在13号染色体。