诱导子对丹参酚酸类化合物含量及合成酶的影响

本文以丹参叶片愈伤组织为材料,细胞悬浮培养为手段,探讨了水解酪蛋白(Casein acids hydrolysate, CAH)、钴离子(Co2+)、丹参根腐病病原菌(Fusarium solani, FS)、密环菌(Armillaria mellea, AM)和水杨酸(salicylic acid, SA))等5种诱导子对培养细胞的生长、丹参酚酸类化合物的合成积累、酚酸类化合物代谢途径苯丙氨酸解氨酶(PAL)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)、肉桂酸4-羟化酶(C4H)、多酚氧化酶(PPO)四种酶的活性以及与细胞抗氧化相关酶活性的影响。为提高培养细胞中丹参酚酸类化合物(丹酚酸B、咖啡酸)的含量及调控酚酸类的代谢提供依据。 1.丹参酚酸类化合物合成代谢途径相关酶PAL、TAT、C4H、PPO的测定条件为:PAL的最适缓冲液pH 8.8、酶促反应温度37℃、酶促反应时间60 min、底物苯丙氨酸浓度为20 mmol?L-1 ;TAT的最适缓冲液pH 7.3、酶促反应温度37℃、酶促反应时间30 min、底物α-酮戊二酸浓度为17 mmol?L-1 ; C4H的最适缓冲液pH 7.6、酶促反应温度30℃、酶促反应时间30 min、底物肉桂酸浓度为25 mmol?L-1;TAT的最适缓冲液pH 6.0、酶促反应温度30℃、酶促反应时间30 min、底物邻苯二酚浓度为10 mmol?L-1。 2.水解酪蛋白、密环菌、丹参根腐病病原菌诱导子在一定浓度下诱导培养细胞生长量增加,但是浓度过高抑制生长。钴离子、水杨酸诱导子抑制培养细胞的生长,且随浓度的增大,抑制作用增强。培养液pH随水解酪蛋白诱导子浓度而提高,呈先上升后下降的趋势;随丹参根腐病病原菌诱导子浓度增大而降低;密环菌诱导子处理对pH变化不显著;钴离子和水杨酸处理导致悬浮培养液酸化,pH变化随钴离子、水杨酸的浓度增大而逐渐增大。诱导子处理均使细胞培养液的电导率减小,随水解酪蛋白、水杨酸诱导子浓度增大呈先降低后增大的趋势,而密环菌和钴离子诱导子处理引起电导率的变化差异不显著;培养液的电导率随丹参根腐病病原菌处理浓度的增大而急剧降低。 3. 5种诱导子对咖啡酸和丹酚酸B含量影响差异显著。水解酪蛋白、水杨酸、钴离子诱导子在低浓度时诱导咖啡酸和丹酚酸B的合成积累,高浓度时表现出抑制效果;水杨酸可诱导酚酸类化合物分泌到培养细胞外;丹参根腐病病原菌可诱导咖啡酸和丹酚酸B的合成积累;蜜环菌抑制咖啡酸的合成,对丹酚酸B含量影响不显著。 4.外源水杨酸处理诱导丹参PAL、TAT、PPO活性的升高,且随着水杨酸浓度的增大,诱导高峰越提前;PAL、TAT活性与丹参咖啡酸、丹酚酸B含量呈正相关,说明PAL、TAT是丹参苯丙烷代谢途径关键酶;外源水杨酸处理抑制C4H活性, C4H活性与咖啡酸、丹酚酸B含量呈负相关,说明C4H不是丹参苯丙烷代谢途径关键酶。 5.水杨酸诱导子诱导SOD、POD、CAT活性升高,但诱导时间和强度与水杨酸的浓度有关,具有差异性。水杨酸诱导子浓度越大,诱导SOD活性高峰出现时间越早;不同浓度的水杨酸诱导POD活性高峰均出现在8 h;诱导CAT活性高峰与浓度成负相关,即浓度越小,诱导活性高峰出现的时间越早。水杨酸诱导子诱导培养细胞内可溶性蛋白含量升高,但差异不显著,3个浓度(SA1(5 mg/L)、SA2(31.25 mg/L)和SA3(93.75 mg/L))水平的水杨酸均可使细胞内可溶性蛋白外渗。