杜仲有效组分预防废用性骨质疏松作用及机制研究

目的杜仲作为我国名贵滋补药材，具有补肝肾、强筋骨等功效，在传统中医及现代医学中被广泛应用以治疗骨相关疾病。本课题在前期实验基础上，对杜仲促成骨有效组分进行筛选找出活性部位，并在动物水平对其预防废用性骨质疏松作用进行研究，进一步在分子水平揭示其防治骨质疏松的作用机制。 方法以杜仲提取物中总木脂素含量为考察指标，采用Plackett-Burman二水平实验从提取溶剂种类、浓度、提取时间、温度、次数、杜仲皮粉碎程度及料液比七个因素中筛选影响总木脂素含量的主要因素，进一步采用响应面法对提取工艺进行优化以提高杜仲提取物中总木脂素的含量。 采用尾悬吊法建立大鼠废用性骨质疏松模型，以阿仑膦酸钠为阳性对照药物，研究杜仲提取物及其有效组分对废用性骨质疏松的预防作用。大鼠灌胃给药两周后实施尾悬吊，尾悬吊时间为四周并在尾悬吊过程中持续每天灌胃给药。实验结束后，观察大鼠主要脏器有无病变并计算脏器指数；采用全自动生化仪及ELISA法对大鼠血清和尿液中钙、磷水平以及骨代谢相关指标进行测定；采用双能X射线骨密度仪测定骨密度；采用三点弯曲实验对大鼠股骨生物力学性能进行分析；采用microCT分析大鼠股骨干骺端的骨小梁微结构特性。 培养类成骨细胞株MC3T3-E1和大鼠原代成骨细胞，采用MTT法、碱性磷酸酶活性测定和矿化结节茜素红染色等方法，筛选杜仲促进成骨细胞增殖、分化及矿化的有效组分。采用HPLC法测定有效组分中主要化合物含量。 采用实时定量PCR和Western blot法研究杜仲40组分、松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷和京尼平苷对骨代谢相关信号通路的mRNA及蛋白表达量的影响。 结果Plackett-Burman二水平实验结果显示影响提取杜仲总木脂素的三个主要因素为乙醇浓度，提取时间和提取温度。对这三个因素进行响应面实验设计及分析，得到最优提取工艺为：将杜仲皮粉碎至40目，以液料比为10:1的体积加入62%乙醇，在72°C下提取111min，提取次数为2次。此时，杜仲提取物中总木脂素含量为1.86±0.012%，杜仲提取物得率为12.35±0.26%。 大鼠尾悬吊4周后体重下降，但脏器指数无显著差异，杜仲提取物和杜仲40组分治疗对尾悬吊引起的体重下降和脏器指数都无显著影响。尾悬吊大鼠血清中抗酒石酸酸性磷酸酶及尿中的脱氧吡啶啉、Ⅰ型胶原C-末端交联肽和Ⅰ型胶原N-末端交联肽含量均明显升高，同时尿中的钙、磷含量也增加，提示骨吸收增强。骨形成指标碱性磷酸酶和骨钙素在尾悬吊后则下降。杜仲提取物与杜仲40组分显著抑制骨吸收指标的上升，并增加骨形成指标，而阿仑膦酸钠治疗仅可抑制骨吸收指标上升。与尾悬吊相比，杜仲提取物与杜仲40组分显著抑制尾悬吊造成的骨密度下降，保护股骨骨小梁的微结构，改善大鼠的股骨生物力学性能。 杜仲提取物经有机溶剂分段萃取后得到石油醚组分、二氯甲烷组分、乙酸乙酯组分和水相组分，其中水相部位对MC3T3-E1和原代成骨细胞的增殖、分化和矿化的能力最强。进一步用大孔树脂分离水相组分后得到，20组分、40组分、60组分和80组分，其中40组分可以显著促进MC3T3-E1和原代成骨细胞的增殖，分化和矿化。HPLC结果显示杜仲40组分中松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷和京尼平苷含量分别为28.63±1.46%、17.24±0.89%和14.87±0.94%，三种单体化合物可不同程度显著促进类成骨细胞株MC3T3-E1和原代成骨细胞的增殖，分化和矿化。 成骨细胞培养过程中加入杜仲40组分、松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷和京尼平苷24h可以显著提高BMP-2信号通路中BMP-2、p38、P-p38、ERK、P-ERK和Runx-2蛋白的表达。同时，杜仲40组分和松脂醇二葡萄糖苷还可提高OPG/RANKL/RANK信号通路OPG的表达、降低RANKL表达。 结论杜仲总提取物及其有效组分即杜仲40组分对大鼠尾悬吊所致骨质疏松具有明显的预防作用，能明显抑制尾悬吊引起的骨质减少，保护股骨骨小梁的微结构，改善大鼠的股骨生物力学性能。杜仲40组分是杜仲促成骨作用的有效组分，其中有效成分为松脂醇二葡萄糖苷、桃叶珊瑚苷和京尼平苷等化合物。BMP-2和OPG/RANKL/RANK信号通路可能是杜仲有效组分发挥其促进成骨作用的主要作用途径。