花姜酮对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤的作用及其机制探讨

第一部分：静脉注射花姜酮治疗重症急性胰腺炎大鼠的量效关系 目的：探讨一种天然植物提取物花姜酮治疗重症急性胰腺炎(SAP)大鼠的量效关系,为花姜酮干预重症急性胰腺炎大鼠肝损伤提供合适的用药剂量。 方法：48只wistar大鼠,雄性,随机分为6组(N=8)。正常对照组(CON组),重症急性胰腺炎组(SAP组),花姜酮预处理组5mg/kg (ZER5mg/kg),花姜酮预处理组10mg/kg (ZER10mg/kg),花姜酮预处理组20mg/kg (ZER20mg/kg),花姜酮预处理组40mg/kg (ZER40mg/kg)。采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g)制备重症急性胰腺炎大鼠模型,于模型制备前30min由股静脉给予不同浓度(5、10、20、40mg/kg)的花姜酮溶液。模型制备后12h处理大鼠,以干棉球吸附大鼠腹水；心脏穿刺取血分离得到血清；取大鼠右肺中叶计算肺湿干比；取大鼠胰腺组织经4%多聚甲醛固定。分别测定各组腹水量、血清淀粉酶(AMY)和肝肾功能(ALT、Cr值)、肺湿干比(反应肺脏含水量)、HE染色观察各组胰腺组织病理学改变并评分。 结果：重症急性胰腺炎组(SAP组)腹水量、血清AMY、ALT、Cr值、肺湿干比、胰腺病理评分均较正常对照组(CON组)显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。 ZER5mg/kg上述指标与SAP组无显著差别。ZER10mg/kg、ZER20mg/kg、ZER40mg/kg三组上述指标中腹水量、血清AMY、肺湿干比、胰腺病理评分均较SAP组显著降低,差异有统计学意义(P<0.05)。但ZER20mg/kg与ZER40mg/kg两组血清ALT、Cr值较高,与SAP组无统计学差异,而ZER10mg/kg组血清ALT、Cr值与SAP组相比明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：5mg/kg花姜酮不能有效缓解胰腺炎病情,10、20、40mg/kg花姜酮均能较好的缓解胰腺炎病情,降低腹水量、血清淀粉酶、胰腺病理评分。而20、40mg/k花姜酮虽能缓解胰腺炎病情,但肝肾毒性较大。因此认为10mg/kg为治疗重症急性胰腺炎的最佳有效剂量。 第二部分：花姜酮对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤的作用 目的：探讨花姜酮对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤的作用,为重症急性胰腺炎大鼠肝脏保护提供理论依据。 方法：70只wistar大鼠,雄性,随机分为4组。正常对照组(CON组)(N=10)；重症急性胰腺炎组(SAP组)(N=40)；花姜酮预处理组(ZER组)(N=10),花姜酮药物对照组(Drug-CON组)(N=10)。其中重症急性胰腺炎组(SAP组)又分四个时间点1h,3h,6h,12h (N=10).重症急性胰腺炎组及花姜酮预处理组大鼠采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/1OOg)制备重症急性胰腺炎模型,正常对照组及花姜酮药物对照组翻动胰腺和十二指肠。花姜酮预处理组及花姜酮药物对照组于模型制备前30分钟由股静脉穿刺给予10mg/kg的花姜酮溶液。正常对照组、花姜酮预处理组、花姜酮药物对照组于12h处死大鼠,重症急性胰腺炎组分1h、3h、6h、12h四个时间点处死大鼠。以干棉球吸附各组大鼠腹水。以5m1注射器心脏穿刺抽血,经离心机分离得到血清；取部分大鼠胰腺胰头组织及大鼠肝脏右叶经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋。分别测定各组大鼠死亡率、腹水量、血清淀粉酶(AMY)和磷脂酶水平,测定反映肝脏功能的谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平(ALT、AST值)、并行胰腺和肝脏光镜下常规病理学HE染色检查。 结果：花姜酮药物对照组大鼠死亡率、腹水量、AMY、磷脂酶水平、ALT、 AST值、以及胰腺和肝脏组织病理学评分(级)同正常对照组,差异无统计学意义。重症急性胰腺炎组大鼠死亡率、腹水量、AMY、磷脂酶水平、ALT、AST值、以及胰腺和肝脏组织病理学评分(级)明显高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。花姜酮预处理组大鼠上述指标与重症急性胰腺炎组相比明显降低(P<0.05),但均高于正常对照组水平。 结论：应用花姜酮可以降低大鼠死亡率,减轻大鼠腹水量,减轻胰酶及肝脏酶学,减轻胰腺和肝脏的病理学损伤；对重症急性胰腺炎大鼠胰外脏器-肝脏的损伤起到了保护作用。然而花姜酮药物本身对正常大鼠无明显副作用。 第三部分：花姜酮对重症急性胰腺炎大鼠肝损伤保护作用的机制探讨 目的：本文前两部分已经证实花姜酮对重症急性胰腺炎大鼠的胰外脏器-肝脏具有保护作用,本部分进一步探讨静脉给药对大鼠重症急性胰腺炎肝损伤保护作用的机制。 方法：70只wistar大鼠,雄性,随机分为4组。正常对照组(CON组)(N=10)；重症急性胰腺炎组(SAP组)(N=40)；花姜酮预处理组(ZER组)(N=10),花姜酮药物对照组(Drug-CON组)(N=10)。其中重症急性胰腺炎组(SAP组)又分四个时间点1h,3h,6h,12h(N=10)。重症急性胰腺炎组及花姜酮预处理组大鼠采用胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠溶液(0.1ml/100g)制备重症急性胰腺炎模型,正常对照组及花姜酮药物对照组则向胆胰管注入等量生理盐水。花姜酮预处理组及花姜酮药物对照组于模型制备前30分钟由股静脉穿刺给予10mg/kg的花姜酮溶液。正常对照组、花姜酮预处理组、花姜酮药物对照组于12h处死大鼠,重症急性胰腺炎组分1h,3h,6h,12h四个时间点处死大鼠。取部分大鼠胰腺胰头组织及大鼠肝脏右叶经4%多聚甲醛固定后石蜡包埋。取部分大鼠胰腺胰头组织及大鼠肝脏右叶至-80°冻存。行免疫组化法检测各组大鼠胰腺及肝脏核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB) p65的表达水平,提取各组大鼠核蛋白行Western blot蛋白印迹法测定各组大鼠核因子-κB表达,提取各组大鼠浆蛋白测定及核因子-κB抑制蛋白I-κB (Inhibitor κB, I-κB)水平,逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-reverse transcription, RT-PCR)检测各组大鼠胰腺及肝脏细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule, ICAM-1)及白介素-1(Interleukin, IL-1) mRNA表达水平。 结果：随着时间点的延长,重症急性胰腺炎组大鼠胰腺组织细胞核NF-κB蛋白的表达逐渐增加,6小时达高峰后表达下降,但仍高于正常对照组水平。给予花姜酮预处理后,能够明显减少NF-κB蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。胞浆内I-κB蛋白的表达变化与NF-κB蛋白相反。免疫组化定位结果提示重症急性胰腺炎组大鼠胰腺组织表达NF-κB主要位于细胞核内,而正常对照组大鼠胰腺组织NF-κB表达主要位于细胞浆。重症急性胰腺炎组大鼠肝脏组织细胞核NF-κB蛋白的表达逐渐增加,12小时达高峰。给予花姜酮预处理后,能够明显减少NF-κB蛋白的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。胞浆内I-κB蛋白的表达变化与NF-κB蛋白相反。免疫组化定位结果提示重症急性胰腺炎组大鼠肝脏组织表达NF-κB主要位于细胞核内,而正常对照组大鼠肝脏组织NF-κB表达主要位于细胞浆。ICAM-1及IL-1结果提示应用花姜酮后,花姜酮预处理组大鼠的PCR产物表达明显低于重症急性胰腺炎组大鼠,差异有统计学意义(P<0.05)。 结论：花姜酮可以通过减少重症急性胰腺炎大鼠胰腺及肝脏组织NF-κB蛋白表达,进而抑制炎症瀑布效应分子ICAM-1和IL-1,从而达到对胰腺炎肝损伤的保护作用。