免培奶牛瘤胃混合微生物基因组资源的初步研究分析

在自然界生物圈里微生物分布最广、生物量最大(约占总生物量的60%)、物种及代谢多样性(约为3.8 亿年进化的产物)最丰富,且其中蕴含着极丰富的基因资源,因此吸引了越来越多的学者对不同环境微生物的研究和开发。例如对湖泊、海洋、土壤等环境已经做了很多方面的研究。 环境瘤胃是由大量的古菌、细菌、真菌和原生动物组成的复杂的独特的微生物生态系统,不仅含有物种丰富的基因资源,还在反刍动物营养代谢中有独特的功能。瘤胃微生物在秸秆纤维降解过程和营养组分转化摄取过程中起到十分重要的作用,它能将这些秸杆废弃物转变为反刍动物可吸收的形式能量、蛋白质、必需氨基酸和维生素等营养物质,所以有很多关于瘤胃微生物的研究。尽管关于瘤胃微生物研究已有几十年历史,但由于瘤胃环境的特殊和培养技术的限制,使得人们没有认识到其中的绝大多数微生物。而免培养技术的兴起和应用,为研究特殊环境微生物多样性提供了有效的手段,人们已经可以不依赖微生物菌种分离培养而直接从分子水平上研究微生物资源。 本研究采用免培技术研究免培环境瘤胃微生物。首先,摸索从瘤胃液样品中抽提、分离和纯化混合瘤胃微生物基因组DNA 的方法。瘤胃微生物混合DNA 的提取率为每毫升瘤胃样品0.1～0.3μg。其次,以粗提DNA 直接为模板,用细菌16s rDNA 通用引物进行PCR,回收PCR 产物构建16s rDNA 文库,通过测序建立系统发育树,进行瘤胃微生物的初步系统发育关系分析,发现一些新序列并向Genbank 提交得到序列号。再次,采用试剂盒纯化粗提混合基因组DNA,用限制性内切酶EcoRⅠ部分酶切经纯化后的基因组DNA 构建以pSK(+)(pBluescript ⅡSK(+))为载体的混合基因组DNA 质粒文库。由试验鉴定文库得到1.9×105个转化子, 外源插入DNA 片段的平均大小为4.2kb,库容达到7.98×102Mb。建库效率为每毫升环境样品瘤胃获得1000 个左右的含3～10kb 外源随机插入片段的克隆。通过DNA 序列测定和同源性比较,对从文库中随机调取的750 个转化子的序列进行网上比对分析,发现可能编码多种酶和蛋白的新基因。如过氧化氢酶、猛超氧化歧化酶、ATP 酶、dUTPase、GTPase、几丁质酶、木聚糖酶、β-半乳糖酶、β-葡萄糖甘酶、溶血素、假设维生素B1 生物合成蛋白、氮调节蛋白、抑制四环素蛋白、运输镁蛋白、钴蛋白、铁蛋白等。