目的建立D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型,人参皂苷干预老化神经干细胞以后,量化神经干细胞内维持生物学特性的两个内源转录因子SOX2和BMI-1的表达变化,探讨人参皂苷维持和增强老化神经干细胞生物学特性的作用。方法1选取孕15-17天大鼠,采用机械分离胚鼠海马NSCs的方法获得原代NSCs,之后传代培养。对NSCs进行特异性标志物Nestin鉴定,使用免疫荧光染色的方法。2CCK-8法筛选D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度和最佳时间。设置6个不同时间点(6h、12h、24h、48h、60h、72h),种6板,在每个板内设Dmem组、对照组以及不同剂量组(5、10、15、20、25、30、35、40mg/ml),之后加CCK-8,1-4h后用酶标仪测定在450nm处的吸光度,整理数据,绘制标准曲线。3使用课题组前期用MTS法检测NSCs细胞增殖能力筛选出的人参皂苷最佳剂量(lug/ml)及最佳作用时间(24h),采用CCk-8法检测人参皂苷对D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型中老化神经干细胞的影响。4使用Western Blot法检测人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内SOX2和BMI-1蛋白的表达情况,实验分为正常组、老化组和老化加人参皂苷组。首先对三组NSCs细胞提取蛋白,按照蛋白提取试剂盒操作指示进行操作,制备蛋白样品,SDS-PAGE电泳,敷一抗二抗,最后使用凝胶成像仪检测目标蛋白,使用Image Pro Plus7.0软件对条带结果进行分析统计。5免疫荧光及细胞核染色检测正常神经干细胞,老化神经干细胞及人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内特异性标志物Nestin,以及SOX2和BMI-1的表达情况。实验分为正常组、老化组、老化加人参皂苷组,在细胞培养、造模、加人参皂苷并进行前期的免疫荧光常规实验操作以后,加入相应的Nestin、BMI-1、SOX2一抗二抗,加DAPI染色,封片后,在激光共聚焦显微镜下观察荧光标记的细胞并拍照并通过Image Pro Plus7.0图像分析软件分析其阳性细胞数、面密度和光密度。结果1成功分离培养胚鼠海马NSCs,并经免疫荧光证明其表达NSCs特异性标记物Nestin,可进行原代培养和传代培养,纯度为95%以上NSCs。2 D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度剂量是35mg/ml,D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳时间是24h。3采用CCk-8法检测人参皂苷对D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型中老化神经干细胞的影响与正常组相比,老化组吸光值明显下降,差异具有统计学意义(P<0.01)。同老化组相比,人参皂苷组吸光值明显上升,差异具有统计学意义(P<0.01)。4Western Blot法检测人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内SOX2和BMI-1蛋白的表达情况神经干细胞正常组、老化组和人参皂苷组内的SOX2和BMI-1蛋白均阳性表达。神经干细胞老化组与正常组相比,SOX2表达明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),神经干细胞人参皂苷组与老化组相比,SOX2表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。神经干细胞老化组与正常组相比,BMI-1表达明显降低,差异具有统计学意义(p<0.01),神经干细胞老化加人参皂苷组与老化组相比,BMI-1表达明显升高,差异具有统计学意义(p<0.01)。5免疫荧光及细胞核染色检测正常神经干细胞,老化神经干细胞及人参皂苷作用老化神经干细胞后神经干细胞内特异性标志物Nestin,以及SOX2基因和BMI-1基因的表达情况NSCs正常组、NSCs老化组和NSCs人参皂苷组均有Nestin、SOX2、BMI-1阳性表达。与NSCs正常组相比,NSCs老化组的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和阳性细胞数均显著减少,差异具有统计学意义(P<0.01);与NSCs老化组相比,NSCs人参皂苷组的Nestin、SOX2、BMI-1面密度、光密度和阳性细胞数均增加,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)结论D-半乳糖致神经干细胞体外老化模型的最佳浓度剂量是35mg/ml,最佳时间是24h。人参皂苷可以促进老化NSCs中SOX2和BMI-1表达增加,证明人参皂苷能维持和增强衰老神经干细胞生物学特性,与人参延缓脑老化的临床作用密切相关。
