肝脏靶向性导入TGF-β1siRNA对急性肝损伤大鼠TGF-β/Smad信号传导通路的影响

目的①改良一种肝靶向性给药途径的体外留置性肝动脉插管动物模型；②构建启动大鼠肝组织中的TGF-β／Smad信号传导通路的急性肝损伤动物模型；③运用RNAi技术研究TGF-β1、TGF-β1R siRNA联合对TGF-β／Smad信号传导通路的干预作用；④比较外源基因进入靶细胞四种方式转染效果差异，建立和评价肝动脉插管给药的优越性。 方法（1）大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型的建立：对Lindell肝动脉插管法进行改进，在10倍手术显微镜下，采用特制内径0．5mm导管（由硬膜外麻醉导管加工而成）经胃十二指肠动脉剪口处插入动脉血管内，逆行到达肝固有动脉开口处后留置导管并固定； （2）肝动脉插管留置及假手术5天后的大鼠急性肝损伤模型：在随后的第1天和第5天，分别予25％四氯化碳花生油溶液（CCl4）6ml／kg体重，腹腔注射，自由饮用水，进食普通颗粒饲料，造成急性肝损伤，第二次四氯化碳48h后处死所有动物； （3）TGF-β1、TGF-β1R siRNA联合对TGF-β／Smad信号传导通路的干预实验：针对肝组织中的TGF-β／Smad信号传导通路中的TGF-β1及TβRⅠ、TβRⅡ分别构建三个不同靶点的siRNA，36只模型鼠随机分为6组，每组6只，分别为模型对照（M）组，TGF-β1 siRNA干预（T）组，TGF-β1 siRNA+TβRⅠsiRNA干预（T+R1）组，TGF-β1siRNA+TβRⅡsiRNA干预（T+R2）组，TGF-β1 siRNA+TβRⅠsiRNA+TβRⅡsiRNA干预（T+R1+R2）组，和空白对照（N）组。实验的第5天（第二次CCl4后约0．5h），将所需导入的siRNA质粒溶于2ml林格氏液，由尾静脉注射导入siRNA 50μg（联合用药的则各为50μg），M组将无关siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液，从尾静脉注射导入；48小时后处死所有大鼠； （4）siRNA质粒四种导入方法的抗肝损伤与抗肝纤维化的疗效比较：30只模型鼠随机分为5组，每组6只，分别为模型对照（M）组、尾静脉直接注射（V）组、脂质体包裹（L）组、流体动力学法（H）组，和肝动脉插管（A）组。在实验的第5天（第二次CCl4后约0．5h），V组及A组将所需导入的TGF-β1 siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液，分别从尾静脉及肝动脉插管导入；L组将所需导入的TGF-β1 siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液后，再加入脂质体LipofectamineTM 2000 250μg（脂质体：siRNA质粒为5：1），室温混合15分钟后，由尾静脉注射导入；H组将所需导入的TGF-β1siRNA质粒50μg溶于容量占自身体重10％的林格氏液中，经45mm头皮注射针尾静脉10秒内快速注射完毕；M组将无关siRNA质粒50μg溶于2ml林格氏液，从尾静脉注射导入；48小时后处死所有大鼠； （5）各实验组大鼠处死后检测：血清指标ALT、AST、HA；肝组织HE染色病理检测；PT-PCR技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad3、PCNA和TGF-αmRNA表达；免疫组化技术检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad3、PCNA和TGF-α蛋白的表达。 结果（1）20只大鼠在构建肝动脉插管并体外留置模型实验中，术中2只因胃十二指肠动脉剪口处血管断裂无法插管；1只手术后死亡，成功者17只，成功率为85％。 （2）急性肝损伤大鼠肝组织中TGF-β／Smad信号传导通路的启动实验中，模型组及肝动脉插管组与空白对照组比较：在血清肝功能指标ALT、AST及肝纤维化指标HA上明显上升（P＜0．01）；通过肝组织HE染色病理观测，肝细胞出现明显炎症、变性、坏死，纤维组织增生等现象；PT-PCR检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad3 mRNA表达显著增强（P＜0．01）；免疫组化检测α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、TGF-β1、Smad3蛋白的表达增强（P＜0．05）；而模型组与肝动脉插管组比较，在以上指标中差异不明显，无统计学意义（P＞0．05）；以上表明，通过插管留置或假手术，加上四氯化碳急性损伤，均能成功启动大鼠肝组织中的TGF-β／Smad信号传导通路。 （3）TGF-β1、TGF-β1 R siRNA联合对TGF-β／Smad信号传导通路的干预实验中，通过实验指标的比较表明：四个治疗组均能有效干预大鼠肝组织TGF-β／Smad信号传导通路，起到抗肝损伤及抑制肝纤维化的效果（P＜0．05）；T+R1+R2组效果最好，T组效果最差（P＜0．05）；T+R1组与T+R2组间差异无显著性意义（P＞0．05）。 （4）siRNA质粒四种导入方法的抗肝损伤与抑制肝纤维化的疗效比较实验中，通过实验指标的比较表明：抗TGF-β1siRNA质粒经过以上四种导入方法转染入靶细胞，均能有效地阻断大鼠肝组织中的TGF-β／Smad信号传导通路的传导（P＜0．05）；四种导入方法比较，肝动脉插管组与脂质体包裹组效果相当（P＞0．05），但优于尾静脉直接注射组及流体动力学法组（P＜0．05），尾静脉直接注射组效果最差（P＜0．05）。 结论①大鼠肝动脉插管并体外留置改良模型具有创建技术方法简单、肝损伤性小、成功率高的特点；②致急性肝损伤，启动大鼠肝组织中的TGF-β／Smad信号传导通路的动物模型能明显观察到肝纤维化过程中关键环节TGF-β／Smad信号传导通路的激活。该模型在评价抗肝纤维化药物及方法时具有耗时少、有效和经济的特点，值得进一步研究；③针对TGF-β／Smad信号传导通路中的TGF-β1及其Ⅰ型受体（TβRⅠ）、Ⅱ型受体（TβRⅡ），的siRNA联合治疗对该信号传导通路的干预具有协同作用，联合用药显著高于单靶点用药效果；④siRNA质粒经肝动脉插管途径转染，是一种安全、方便、高效的外源基因肝脏靶向导入转染方法。