柏木醇对大鼠佐剂性关节炎的作用及机制研究

研究背景和研究目的：类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种病因尚未明了的慢性全身性炎症性疾病,临床表现主要为慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变,属于自身免疫炎性疾病,与环境、细胞、病毒、遗传、性激素及神经精神状态等因素密切相关。由于增生的成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synovi ocytes, FLS)能产生大量的炎症介质,因此其在炎症和关节损伤的传播方面发挥了关键的作用。柏木醇是一种倍半萜醇,广泛应用于木香、辛香和东方型香精中,也大量用作消毒剂和卫生用品的增香剂。已有实验结果表明,大鼠和小鼠吸入柏木醇具有镇静安神作用。然而,柏木醇在RA方面的研究还没有报道。本课题的目的是研究柏木醇对佐剂性关节炎(Adjuvant arthritis, AA)大鼠和AA大鼠FLS的作用。 方法：通过大鼠尾巴根部皮内注射完全弗氏佐剂0.1ml/只(含卡介苗lmg)进行诱导AA大鼠。大鼠致敏前测定两后足容积,随后分别于致敏后第21天、第28天测定两后足容积。在致敏后第18天、21天、25天、28天对大鼠两后足进行评分,按《中药新药研究指南》有关AA继发性病变评分法,观察足爪肿胀度、前肢和尾部病变的发生率、结节数或严重度。在致敏后第28天,用MTT法测定T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖,以及IL-1和IL-2的诱生,取大鼠膝关节,用苏木精-伊红染色进行组织学检查,用免疫组化分析COX-2表达。取AA大鼠滑膜组织,分离出FLS。用实时RT-PCR检测COX-1, COX-2, MMP-13和MCP-1mRNA的表达。用Western Blot和ELISA分别测定COX-1、COX-2和PGE2、IL-1β,TNF-α蛋白的表达。用Western Blot检测NF-κB和MAPK信号通路。 结果： 1)柏木醇对AA大鼠的影响：与模型组关节炎评分和两后足足容积比较后显示,柏木醇5、10、20mg/kg组以及阳性对照药强的松2.5mg/kg组对佐剂注射后引起足爪继发性肿胀反应有显著的治疗作用。试验结束时取胸腺和脾脏称重,结果显示柏木醇对免疫器官有抑制作用。表明柏木醇的抗炎作用可能与免疫抑制作用相关。2)柏木醇对AA大鼠T、B淋巴细胞增殖的影响：柏木醇5、10、20mg/kg组和强的松组的T、B淋巴细胞增殖比模型组显著降低(P<0.05～0.001),柏木醇5、10、20mg/kg和强的松组对T淋巴细胞的抑制率分别为22.0%、21.7%、39.2%和82.9%,柏木醇5、10、20mg/kg组和强的松组对B淋巴细胞呈剂量依赖的抑制率分别为13.2%、14.0%、27.0%和60.6%,表明柏木醇对大鼠T、B淋巴细胞增殖有抑制作用。 3)柏木醇对AA大鼠IL-1的影响：柏木醇5、10、20mg/kg组和强的松组的IL-1诱生比模型组显著降低(P<0.05～0.001),柏木醇5、10、20mg/kg组和强的松组对IL-1诱生的抑制率分别为16.3%、14.9%、17.8%和89.2%,表明柏木醇抑制大鼠腹腔巨噬细胞生成IL-1。 4)柏木醇对AA大鼠IL-2的影响：柏木醇5、10、20mg/kg组和强的松组的IL-2诱生比模型组显著降低(P<0.05～0.001),柏木醇5、10、20mg/kg组和强的松组对IL-2诱生的抑制率分别为6.2%、11.7%、8.4%和91.0%,表明柏木醇能抑制大鼠脾淋巴细胞生成IL-2。 5)HE染色结果：通过光学显微镜观察HE染色的病理切片,发现柏木醇20mg/kg组和强的松组的滑膜炎症细胞浸润和纤维组织增生的程度均比模型组低。 6)免疫组化结果：用COX-2抗体作为一抗进行免疫组化分析,通过光学显微镜观察,发现模型组COX-2的表达增加,而柏木醇20mg/kg组和强的松组与模型组相比,COX-2的表达明显减少。 7)柏木醇对LPS诱导FLS IL-1β,TNF-α蛋白水平表达的影响：与模型组相比,柏木醇(1,5,10μM)和吲哚美辛(20gM)组均能统计学显著(P<0.05～0.001)抑制IL-1β和TNF-α蛋白水平的表达。 8)柏木醇对LPS诱导FLS COX-1, COX-2mRNA和蛋白水平表达的影响：与模型组相比,柏木醇(10gM)和吲哚美辛(20μM)组均能统计学显著(P<0.05-0.001)抑制COX-1和COX-2mRNA和蛋白水平的表达。 9)柏木醇对LPS诱导FLS PGE2表达的影响：与模型组相比,柏木醇(5,10μM)和吲哚美辛(20pM)组均能统计学显著(P<0.05-0.001)抑制PGE2表达。 10)柏木醇对LPS诱导FLS MMP-13和MCP-1mRNA水平表达的影响：与模型组相比,柏木醇(5,10μM)和吲哚美辛(20μM)组均能统计学显著(P<0.05-0.001)抑制MMP-13和MCP-1mRNA水平的表达。 11)柏木醇对LPS诱导FLS NF-κB和MAPKs信号通路的影响：用Western Blot法分析显示,柏木醇经过MAPK信号通路的ERK通路,连接到NF-κB信号通路,从而对炎症因子的表达产生影响。 结论： 1)柏木醇对AA大鼠多发性关节炎、关节局部肿胀及病理形态等具有明显的改善作用,恢复异常的免疫功能,抑制滑膜细胞增殖,因此柏木醇可能是治疗RA的潜在药物。 2)抑制MAPK的ERK通路和NF-κB信号通路可能是柏木醇对AA大鼠产生抗炎作用的机制之一。