玄参药材的品质评价研究

中药玄参为玄参科玄参属植物玄参(Scrophulaia ningpoensis Hemsl.)的干燥根。别名元参、墨参、浙玄参等,主要分布于我国的长江流域,现多为栽培品。始载于《神农本草经》,列为中品。李时珍释其名曰:“玄,黑色也”,其茎似人参,故得参名。玄参性微寒,味甘、苦、咸,归肺、脾、肾经,清热凉血,滋阴降火,解毒散结。用于热入营血,温毒发斑,热病伤阴,舌绛烦渴,津伤便秘,骨蒸劳嗽,目赤,咽痛,白喉,療疬,痈肿疮毒。然而,产地、采收、加工、“发汗”方法等因素对玄参药材有效成分造成一定的影响,导致药材质量参差不齐。如何在药材生产过程中,保证玄参药材的优质和质量均一已成为其生产过程中的关键问题。本课题通过对玄参药材中多元功效成分的系统分析,比较不同产地、不同采收时间、不同加工方法和不同“发汗”条件玄参中各功效成分的变化;采用UFLC-TripleTOF-MS/MS技术对玄参进行植物代谢组学研究,分析、比较不同产地、不同采收时间、不同加工方法及不同“发汗”条件玄参化学成分及其差异,筛选、鉴定差异化学成分,并找出其量的变化规律;采用荧光原位杂交技术(FISH)对玄参“发汗”过程中不同阶段的样品进行测定,分析比较玄参“发汗”过程中不同阶段微生物群落结构变化;结合菌种分离纯化技术得到玄参中内生菌种,并采用超快速液相色谱-串联四极杆飞行时间高分辨质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)结合多元统计分析技术对不同菌种接种玄参及“发汗”玄参与灭菌后烘干玄参化学成分的差异性进行分析。课题研究内容主要包括以下几个方面:1、文献研究系统查阅玄参国内外相关文献,对其进行文献综述研究。2、玄参多元指标成分的分析采用现代分析技术对不同产地、不同采收时间、不同加工方法和不同“发汗”条件玄参中指标成分进行比较分析,并采用灰色关联度、TOPSIS和DTOPSIS等对玄参中指标成分进行综合评价。建立了UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定环烯醚萜苷(哈巴苷、哈巴俄苷、梓醇、桃叶珊瑚苷)、苯丙素苷(毛蕊花糖苷、安格洛苷C)、有机酸(肉桂酸、咖啡酸、对香豆酸、阿魏酸、对甲氧基肉桂酸、反式丁烯二酸)12种多元功效成分的方法;建立UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定玄参中10种核苷类成分的方法;建立了UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定环烯醚萜苷、苯丙素苷、有机酸、核苷、氨基酸39种化学成分进行分析。采用ICP-MS测定不同产地和不同采收时间玄参中24种无机元素。结果显示:不同采收时间玄参中各成分呈现动态变化;不同产地及商品药材、不同加工和不同“发汗”条件各成分差异明显。3、玄参UFLC-Triple TOF-MS/MS植物代谢组学分析建立UFLC-Triple TOF-MS/MS结合多元分析技术,对不同产地、采收时间、加工方法、“发汗”条件玄参中化学成分组成进行分析。根据质谱数据,结合软件数据库和相关文献搜索进行成分鉴别;采用PCA、PLS-DA和OPLS-DA找出不同产地、采收时间、加工方法、“发汗”条件中差异化学成分及其变化规律。结果显示:不同产地玄参中化学成分组成均差异显著,进一步OPLS-DA分析筛选出11个共有差异成分；不同采收时间中筛选出10个共有差异成分,且呈现出动态变化的趋势;不同加工方法玄参中筛选出12个共有差异成分,且呈现动态变化;不同“发汗”条件玄参中化学成分差异显著,筛选出8个化学成分为共有差异成分。4、玄参“发汗”过程中微生物群落结构分析及其对化学转化的影响本实验采用荧光原位杂交技术(FISH)对玄参“发汗”过程中不同阶段的样品进行测定,分析比较玄参“发汗”过程中不同阶段微生物群落结构变化。结合菌种分离纯化技术得到玄参中内生菌种,并采用超快速液相色谱-串联四极杆飞行时间高分辨质谱(UFLC-Triple TOF-MS/MS)结合多元统计分析技术对不同菌种接种玄参及“发汗”玄参与灭菌后烘干玄参化学成分的差异性进行分析。通过二级串联质谱分析,对其质谱数据进行峰匹配、峰对齐、滤噪处理等进行特征峰提取;用主成分分析(PCA)和偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)进行数据处理;根据一级质谱精确质荷比和二级质谱碎片信息,结合软件数据库搜索及相关文献进行成分鉴定。结果显示:不同菌种接种玄参样品与灭菌后直接烘干玄参样品间的化学组成得到有效区分;初步筛选并鉴定出4号真菌接种玄参及“发汗”玄参与灭菌后烘干玄参样品间29个共有差异化学成分,本研究分析各菌种与化学成分之间的联系,可为探讨玄参药材的品质形成机制及确定与“发汗”相关内生菌菌种提供基础资料,系统科学地探索玄参“发汗”对化学转化与生物转化的影响。