化疗药物是治疗肿瘤的重要手段,具有显著的抗肿瘤作用;但同时对正常细胞也有明显的毒性作用,在临床使用中不良反应多而严重。因此,创制新型抗肿瘤药物十分必要。莪术油是传统中药莪术的挥发油,主要含莪术醇、β-榄香烯等成分,其中莪术醇含量最高。临床有报道莪术醇对宫颈癌有较好的疗效,且无明显不良反应。而β-榄香烯虽也有抗肿瘤作用,但同时具有多种副作用,限制了其应用。本实验自行提取莪术醇,制备莪术油和莪术醇的脂质体,并研究其对肝癌和结肠癌的作用及机理,为临床上利用莪术提取物治疗肿瘤提供理论依据。
方法:
实验采用低温结晶、回流的方法提取莪术醇;鉴定后利用机械分散和超声波结合法制备莪术醇脂质体和莪术油脂质体。体外培养HepG2肝癌细胞和HT-29结肠癌细胞。用生长曲线和MTT法观察莪术醇、莪术油和β-榄香烯对两种细胞生长的影响;用Hoechst 33258/PI双染色、激光共聚焦观察法和DNA凝胶电泳法测定细胞凋亡情况;分别采用RT-PCR、免疫组化法测定HepG2细胞和HT-29细胞中COX-2 mRNA和VEGF mRNA表达情况、荷H22细胞小鼠肿瘤组织中COX-2和VEGF的表达情况。
结果:
自行从莪术油中提取出莪术醇,得率为2.574%。莪术醇和莪术油脂质体颗粒大小主要集中在直径100～1000nm,包封率分别为86.2%和74.5%。
生长曲线显示27 μg/ml莪术醇可明显减少第6、7天时HT-29细胞数和第6天时HepG2细胞数;MTT法也显示莪术醇(9～80μg/ml)可剂量依赖性地抑制HepG2细胞和HT-29细胞的生长。莪术油和β-榄香烯也可抑制HepG2细胞和HT-29细胞的生长。100mg/kg莪术醇可显著抑制荷瘤小鼠肿瘤增长,抑制率为51.03%(p<0.05),且与莪术油和β-榄香烯相比,差异不显著。
27 μg/ml莪术醇,27 μg /ml莪术油,10 μg /ml β-榄香烯作用于HT-29和HepG2细胞12h,均可引起两者产生DNA“梯状带”的凋亡现象。用Hoechst 33258/PI双染色及激光共聚焦观察凋亡细胞,结果显示,莪术醇、莪术油、β-榄香烯都可引起HepG2和HT-29细胞凋亡率明显增加(p<0.01),其凋亡率分别为30.2%、12%、25.2%和38%、22.4%、44%。
在荷瘤小鼠肿瘤组织中,VEGF和COX-2都有表达,在细胞浆中呈棕色颗粒或团块。莪术醇(100 mg/kg)可明显减少COX-2和VEGF的表达,抑制率分别为31.5%(p<0.01)和43.0%(p<0.01),效果优于莪术油。
莪术醇(9,27,80 μg/ml)、莪术油(9,27,80 μg/ml)和β-榄香烯(10,30 μg/ml)能显著降低HepG2细胞和HT29细胞VEGF mRNA表达量(p<0.05)。
80 μg/ml的莪术醇、80 μg/ml莪术油、30 μg/ml和10 μg/mlβ-榄香烯可明显减少HepG2细胞COX-2的表达量(p<0.05)。80μg/ml和27μg/ml的莪术醇、30 μg/ml和10 μg/mlβ-榄香烯显著降低HT29细胞COX-2的表达量(p<0.01);而莪术油各剂量无明显效果。
结论:
成功地从莪术油中提取出莪术醇,并制备成莪术醇和莪术油脂质体。
莪术醇能明显抑制体外培养的HT-29和HepG2细胞生长,抑制作用呈时间剂量依赖性。
莪术醇能明显抑制 H22荷瘤小鼠肿瘤的增长。
莪术醇在体外可诱导HT-29和HepG2细胞凋亡。
莪术醇可明显抑制 H22荷瘤小鼠肿瘤组织中VEGF和COX-2的表达。
莪术醇在体外可抑制HT-29和HepG2细胞COX-2 mRNA和VEGF mRNA的表达。
