孕期酒精暴露对仔鼠视网膜发育及细胞凋亡的影响

当孕妇在妊娠期滥用酒精时，由于酒精可随血液通过胎盘屏障，除了容易导致流产、死胎外，还可给胎儿在出生后造成一些不可逆的影响，导致各种生长障碍、面部畸形，尤其是对神经系统的发育危害最大，造成胎儿酒精综合症（Fetal alcohol syndrome，FAS）。在FAS中常出现斜眼、小眼畸形、先天性近视、弱视等一些视觉系统的疾病,而这些疾病的发生大多数与视网膜的异常有关。本课题运用C5B/6J小鼠建立妊娠期酒精暴露动物模型，以模拟胎儿酒精综合征的发生，来研究孕期酒精暴露对小鼠视网膜致畸、细胞发育及凋亡等方面的影响，旨在为酒精所致的视觉系统疾病提供病因学研究的理论基础。 目的：研究视网膜的正常发育和细胞分化过程，和酒精对视网膜细胞发育和凋亡方面的影响以及对视网膜的致畸作用。 方法：利用C57BL/6J小鼠建立孕期酒精暴露模型，用HE染色和免疫荧光技术，选取P0、P7、P14和P30仔鼠观察视网膜的正常发育和细胞分化过程，和酒精对视网膜细胞在发育和凋亡方面的影响，以及酒精的对视网膜的致畸作用。 结果：1、视网膜的一般结构的发育：视网膜片层化形成以及水平细胞和双极细胞的发育： (1)视网膜片层化过程： 小鼠刚出生即P0时视网膜仅分化出四层，包括神经节细胞层、内网层、成神经母细胞层和色素上皮层； P7时在成神经母细胞层中间出现外网层，将其分为内颗粒层、外颗粒层，此后外网层增宽，视锥视杆层出现，至P14小鼠睁眼时，视网膜十层结构基本形成。表明视网膜形态学的发育程度与其功能上的完善程度有一致性。 (2)水平细胞和双极细胞的发育： 本研究中选取Doublecortin、PKC-α来分别标记水平细胞和双极细胞。①水平细胞的发育：Doublecortin阳性细胞在P0时已经出现，位于成神经母细胞层内靠近色素上皮层的位置，然后向下集聚，到P7时，Doublecortin阳性细胞到达目标层，树突伸入外网层，和胞体共同呈现出“丁”字形结构，此后，伸入外网层的树突数量逐渐增多，直至P14时树突和胞体共同呈现出扇形结构，至此水平细胞发育基本完成；②双极细胞的发育：P0时,未出现PKC-α阳性细胞； P7时，阳性细胞出现，胞体多层排列位于内核层中紧邻外网层的位置，轴突同节细胞建立联系，但伸入外网层中的树突丛不明显，此后PKC-α阳性细胞数逐渐增多，到P14时，PKC-α阳性细胞变为单层紧密排列，轴突密度增加，外网层中可见大量树突丛，此时呈现出典型的双极细胞形态。 2、酒精暴露对视网膜片层化及水平细胞和双极细胞发育的影响： (1)酒精暴露对视网膜片层化的影响： 在本研究中，通过和对照组作对比，我们发现胎儿期酒精暴露的小鼠在出生后视网膜出现片层化延迟和增厚现象，且具有剂量依赖性和长时程效应。 (2)酒精暴露对水平细胞和双极细胞发育的影响： 在各年龄点中，酒精组的小鼠视网膜水平细胞和双极细胞的数量均减少，具有剂量依赖性和长时程效应；此外，酒精组水平细胞出现极性紊乱，具有剂量依赖性。 3、酒精暴露对视网膜的致畸作用和胞凋亡的影响： 通过对P0各剂量组内视网膜做HE染色观察发现，对照组及低剂量组中未出现畸形视网膜，而高剂量组中畸形率为16%，畸形主要表现为视网膜细胞增殖，致使视网膜增厚加长发生折叠现象。另外，在本实验中，用激活的caspase-3、caspase-8、caspase-9、TUNEL来标记凋亡细胞。经统计学处理后结果显示：在生理情况下，视网膜中节细胞及内颗粒层的细胞是通过死亡受体途径以及线粒体体途径发生凋亡，其中死亡受体是主要凋亡途径；孕期酒精暴露时，酒精在生理凋亡的基础上，通过死亡受体途径和线粒体体途径来诱导小鼠视网膜细胞发生凋亡，且具有剂量依赖性和长时程效应。 综上所述，孕期酒精暴露时可导致子鼠视网膜发育障碍、视网膜功能神经元数量减少和形态异常、视网膜畸形率增加以及视网膜细胞凋亡量增加，而这些可能是导致FAS相关眼病的病理学基础。