心肌样微环境下黄芪甲苷联合5-氮胞苷诱导MSCs分化为心肌样细胞

心肌梗死作为一种发病率和死亡率极高的心血管疾病,严重威胁着人类健康。心肌梗死后存活的心肌减少、继发心室重构,是造成心肌梗死患者发生心力衰竭、心律失常甚至死亡的重要原因,由于心肌细胞不能再生,受损的心肌细胞不能修复和分化,临床药物、介入及手术等治疗手段都不能代替坏死的心肌,所以如何修复坏死心肌细胞是目前心血管研究领域的重要课题。因此,心脏细胞治疗(cardiac cell therapy,CCT)再生功能性心肌细胞成为近年来研究的热点。许多研究证明骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)分化为心肌细胞有良好的应用前景。目前,常用于MSCs诱导分化为心肌细胞的方法主要有化学诱导(诱导分化剂诱导)及生物诱导(心肌微环境诱导)两大类,但都存在着诱导分化率较低的现实问题,如何提高MSCs向心肌细胞的诱导分化效率,是现如今摆在研究者面前亟待解决的重要课题。 近年来随着中医药在干细胞领域研究的不断深入,发现中医药在促进MSCs增殖与向心肌细胞定向分化上能起到积极作用。中药既可直接作用于体内的MSCs促进其增殖、分化,也可影响其微环境,促进其存活与功能的建立,具备较好的应用前景。黄芪及其有效单体成分黄芪甲苷(Astragaloside Ⅳ, AST)就是其中之一。课题前期研究结果也显示,中药单体黄芪甲苷在体外能成功诱导MSCs分化为心肌样细胞,且AST与5-氮胞苷(5-azacytidine,5-aza)联合诱导,可降低5-aza诱导浓度,增强细胞活性。 针对目前MSCs诱导分化心肌细胞诱导分化率较低的现状,在前期研究基础上,本研究采用黄芪甲苷联合化学诱导(5-aza诱导)及生物诱导(心肌微环境诱导)的方法共同干预MSCs向心肌细胞的分化,对比观察AST联合诱导在诱导分化率及诱导后心肌样细胞功能方面存在的差异,说明心肌样微环境下中药AST联合诱导的作用优势,并初探AST在此过程中的可能作用机制,旨在探索提高MSCs向心肌细胞诱导分化更可行、更有效的方法和手段,进而为其临床应用提供理论基础和技术支持。 目的： 探讨在体外心肌样微环境下黄芪甲苷联合5-氮胞苷诱导能否提高骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的诱导分化效率,诱导后细胞是否具备一定类心肌细胞功能。同时初探AST在此过程中的可能作用机制。 方法： 纯种3-4w SD大鼠,SPF级,雌雄不限,体重50g左右,由广州中医药大学动物实验中心提供。取SD大鼠骨髓,通过密度梯度离心和贴壁培养法分离大鼠MSCs,体外扩增、培养,用流式细胞仪鉴定MSCs。连续传代至第八代,将一定量的MSCs以1×104/L密度接种于6孔培养板中,24h后换液,分为5组进行诱导。Ⅰ组：仅更换基础培养基(含10%FBS的L-DMEM培养液)；Ⅱ组：10μmol/L5-aza诱导24h后,更换基础培养基。Ⅲ组：更换含心肌细胞裂解液基础培养基(体外模拟心肌样微环境)；Ⅳ组：100mg/l AST+10μmlol/L5-aza孵育24h后,更换含心肌细胞裂解液基础培养基。V组：10μmol/L5-aza(?)浮育24h后,更换含心肌细胞裂解液基础培养基。诱导2周后,利用免疫组化法对诱导后细胞进行鉴定,观察其是否能表达心肌特异性结构蛋白——肌钙蛋白T(cTnT)、结蛋白(Desmin)及连接蛋白43(Cx43),计算诱导分化效率；观察诱导后细胞心钠素(ANP)mRNA表达水平以及细胞内第二信使环磷酸腺苷的水平(异丙肾上腺素刺激)；同时检测诱导后细胞内HGF及IGF-1含量。 结果： 1.细胞培养72-96h后即可见有细胞贴壁,逐渐变成梭形。培养至14d左右,细胞逐渐融合,连接成大片条索状结构。培养的MSCs表面标志抗原CD34表达率为0.4%,而CD44表达率为98.5%。由此,我们认为在本实验中采用贴壁细胞分离培养法得到的细胞为纯度较高的处于未分化状态的MSCs。符合MSCs表面标志表达的特征。 2.实验结果显示,空白对照组未表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、Desmin及Cx43。各诱导组诱导后心肌细胞特异性蛋白cTnT、Desmin及Cx43的表达均为阳性,与Ⅰ组比较,差异有极显著性意义(P<0.01)。诱导后2w,Ⅳ组镜下见cTnT、Desmin.Cx43表达数量显著高于Ⅱ组、Ⅲ组及V组(P<0.01),诱导分化效率分别达31.22%、36.65%、32.42%。与Ⅱ组比较,Ⅴ组cTnT、Desmin及Cx43表达水平亦有所升高(P<0.05或0.01)。Ⅱ组与Ⅲ组组间cTnT、Desmin表达比较无明显差异(P>0.05)。 3.诱导后2w,与对照组比较,各诱导组MSCs诱导后ANP mRNA表达水平显著升高(P<0.01或0.05)。其中,Ⅳ组ANP mRNA表达水平相对较高,显著高于Ⅱ组、Ⅲ组及V组(P<0.01)。以10-5mmol/l异丙肾上腺素刺激各组诱导后细胞,各诱导组cAMP水平均高于空白对照组(P<0.01)。各诱导组间cAMP水平比较：Ⅳ组cAMP水平显著高于Ⅱ组、Ⅲ组及V组,差异有显著性意义(P<0.01)。 4. MSCs诱导2w后,细胞内HGF、IGF-1水平Ⅲ组、Ⅳ组及V组水平明显高于Ⅰ组及Ⅱ组,差异有显著性意义(P<0.01或0.05),而Ⅰ组与Ⅱ组之间比较无统计学差异(P>0.05)。其中,Ⅳ组诱导后细胞内HGF、IGF-1水平最高,显著高于Ⅱ组、Ⅲ组及Ⅴ组,差异有显著性意义(P<0.01)；Ⅲ组及Ⅴ组组间比较无明显差异(P>0.05)。 结论： 1.在心肌样微环境下AST联合5-aza诱导MSCs向心肌样细胞分化,诱导分化效率高,可高效表达心肌特异性蛋白cTnT、Desmin及Cx-43； 2.在心肌样微环境下AST联合5-aza诱导MSCs向心肌样细胞分化,诱导后细胞与正常心肌细胞不仅形似,更具备良好的生理功能。 3.AST在诱导过程中的作用可能同在心肌样微环境下促进了MSCs旁分泌生长因子HGF、IGF-1有关,间接促成MSCs诱导分化效率的提高；4.在心肌样微环境下AST联合5-aza诱导MCSs向心肌细胞分化是一种可行、有效的诱导手段,存在一定作用优势,值得进一步研究、推广和应用。