乳腺癌雌激素受体细胞定位临床病理意义的研究

背景:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,严重影响患者的健康及生存。寻找乳腺癌预后危险因素及潜在的治疗靶点,是当前乳腺癌研究热点之一。乳腺癌属激素依赖性肿瘤,体内雌激素水平是调控乳腺癌细胞增殖的重要因素,雌激素主要通过雌激素受体（Estrogen receptor,ER）发挥作用。雌激素与ER形成复合体后转移至细胞核,作为一种转录因子,通过调节下游靶基因的转录发挥作用。这种机制称为雌激素的基因组作用模式或核启动的雌激素应答。但近年来研究已经证实,雌激素还存在非基因组作用模式,也称为膜启动的雌激素应答,在这种模式中,雌激素直接与分布在细胞膜/细胞质内的雌激素结合蛋白结合,快速激活细胞内信号传导通路,主要包括ERK/MAPK信号通路、Ras-PI3K通路、JNK通路及第二信使系统等,使细胞产生快速反应,促进细胞发生增殖及恶性转化。关于分布在癌细胞质/膜中的雌激素结合蛋白究竟为何种成分,目前尚无定论。目前在临床上广泛使用免疫组化法检测乳腺癌细胞的ER状态,普遍认为ERα蛋白定位于细胞核内,而质/膜ERα由于其成分尚无定论,临床意义不明,目前尚未引起广泛关注。本课题组在前期工作中发现,部分乳腺癌病例ERα免疫组化染色可见不同程度、不同比例的细胞质/膜着色,目前尚不清楚这些定位于细胞膜和/或细胞质中的蛋白究竟是何种成分以及这种蛋白具有何种临床意义。我们推测该蛋白可能为ERα66的剪切变异体:ERα36。目前,该蛋白在乳腺癌发生、进展中的作用及其对相关治疗药物疗效的影响及机制尚未明确。目的:1、研究ERα蛋白在人乳腺癌组织中的定位,确定是否存在细胞质/膜定位,探讨细胞质/膜ERα表达的临床病理意义及其对患者预后的影响。2、研究乳腺癌病例中质/膜ERα表达与ERα36表达及定位之间的关系,探讨质/膜ERα究竟为何种蛋白。3、研究ERα36高表达后,MCF-7细胞系中ERα蛋白细胞内定位情况以及HER-2、RARα、ki-67蛋白表达量的变化,探讨ERα36促进乳腺癌细胞转移可能的作用机制。方法:1、免疫组化染色法检测ERα蛋白表达量及细胞内定位,以>1%肿瘤细胞出现确切的细胞核和/或细胞质/膜不同强度的黄色细颗粒状着色计为ER核阳性或质/膜阳性。统计分析质/膜ERα蛋白与患者的月经状态、家族史、乳头大导管受累、乳腺癌组织学分级、临床分期、T分期、N分期、M分期、复发、HER-2表达等临床病理特征之间的相关性。2、应用q-PCR方法检测36例人乳腺癌新鲜标本中ERα36、ERα66 m RNA表达量,分析二者与ERα核定位及质/膜定位的相关性;3、应用核蛋白-胞浆蛋白抽提试剂盒分别提取癌细胞的核蛋白和质/膜蛋白,得到高纯度的核蛋白和质/膜蛋白,用Western-blot方法分别在核蛋白样本及质/膜蛋白样本中检测ERα36和ERα66蛋白的表达情况,并对Western蛋白条带扫描,进行灰度分析和计算,分析ERα36和ERα66在细胞内的定位情况。4、构建p IRES2-EGFP-ERα36基因过表达载体,瞬时转染至人乳腺癌细胞系MCF-7中,提取m RNA和蛋白质,分别应用q-PCR和Western-blot方法鉴定ERα36和ERα66表达情况。5、收集转染后MCF-7细胞,制作细胞蜡块,免疫组化方法检测ERα、HER-2及ki-67的表达。6、收集转染后MCF-7细胞,提取总蛋白,Western-blot方法检测HER-2、RARα蛋白表达。结果:1、在1164个病例中,ERα免疫组化染色阳性定位主要位于细胞核,部分病例可观察到细胞质/膜部位着色,质/膜着色可以与核着色同时出现（即核、质/膜均阳性）,也可以单独出现（质/膜阳性,核阴性）。ERα质/膜着色与较高的N分期、较高的HER-2评分及复发转移有关,ERα质/膜阳性患者无进展生存期较短。2、36例样本中共有18例（占50.0%）检测到ERα66和/或ERα36 m RNA,其中10例检测到ERα66m RNA,阳性百分比为27.8%;14例检测到ERα36 m RNA,阳性百分比为38.9%。ERα66与ERα36共同表达的样本共6例,占所有样本的百分比为16.7%。ERα66 m RNA阳性的病例均出现免疫组化核着色,ERα36 m RNA阳性病例除1例以外免疫组化染色均出现ERα细胞质/膜着色。ERα66、ERα36 m RNA表达量分别与ERα免疫组化核定位及质膜定位有显著的相关性（p<0.05）。3、免疫组化ERα核及质/膜均阳性者Western blot显示ERα36和ERα66蛋白均有表达;ERα核阳性者多数为ERα66蛋白表达,少数为ERα36表达;ERα质/膜阳性者仅有ERα36蛋白表达;ERα核及质/膜均阴性者ERα36和ERα66蛋白均未见表达。4、p IRES2-EGFP-ERα36真核表达载体成功转染MCF-7细胞,转染72小时后,转染效率约为70%。q PCR检测结果显示,ERα36基因真核表达载体转染MCF-7细胞后,ERα36基因过表达129.23倍;western-blot检测到特异性ERα36条带,两种结果均证实转染成功。5、转染后MCF-7细胞ERα着色部位变化,除核表达之外,细胞质/膜中也可见阳性着色,进一步证实ERα36主要定位于细胞质或细胞膜;HER-2蛋白表达增加,部分肿瘤细胞胞膜出现阳性着色（1+2+）;ki-67指数增高。6、转染72小时后,p IRES2-EGFP-ERα36与p IRES2-EGFP-NC相比,HER-2蛋白表达量增加,而RARα蛋白表达减少。结论:1、人乳腺癌雌激素受体α（ERα）蛋白表达定位于癌细胞核和/或细胞质/膜中。质/膜ERα主要为ERα36,核ERα主要为ERα66,少部分为ERα36。2、乳腺癌细胞质/膜ERα表达量与癌细胞HER-2表达量呈等级正相关,提示二者之间存在调控关系。3、乳腺癌质/膜ERα阳性组患者淋巴结转移率较高、无进展生存期较短,乳腺癌质/膜ERα表达是一种独立的预后不良因素。4、ERα36促进HER-2蛋白表达,抑制RARα蛋白表达;ERα36可能通过下调RARα促进HER-2蛋白表达增加。