糖皮质激素性骨质疏松症中骨髓间充质干细胞自噬的功能与调控研究

研究目的糖皮质激素目前被广泛应用于非感染性炎症和自体免疫性疾病的临床治疗。长疗程的糖皮质激素会产生多种副作用,其对骨组织的影响会导致糖皮质激素性骨质疏松症(GIOP)。糖皮质激素性骨质疏松症的临床表现包括骨密度下降和骨折。其中骨折在成年患者中的发生率可达30%-50%。过量的糖皮质激素可以通过对成骨细胞,破骨细胞以及骨细胞的直接作用造成骨量丢失。以往的研究表明长期口服糖皮质激素会引起骨细胞和成骨细胞的凋亡,同时可以延长破骨细胞的生存周期。骨髓间充质干细胞(BMSCs)对于维持骨组织动态平衡有着非常关键的作用。BMSCs在骨质疏松症发生机理中扮演着重要角色,近年来其相关研究引起了学者们的广泛关注。由于新骨的形成主要依赖于由BMSCs分化而成的成骨细胞,高浓度糖皮质激素对BMSCs的负面影响毫无疑问会造成GIOP中的骨量丢失。因此,GIOP中BMSCs功能和数量的保护对疾病治疗来说至关重要。自噬能够在细胞处于应激环境时被激活,成为一种生存倾向性的细胞保护机制。这一生理性过程对于细胞的生长,存活,发育及内环境稳态来说十分重要,在许多疾病的病理生理过程中也被越来越多地提及。然而,自噬是否参与了糖皮质激素对BMSCs造成损伤的过程目前尚不清楚。四甲基吡嗪(TMP),作为从传统药用植物川芎中提取出的生物活性成分,在以往研究中被报道在诸多细胞类型中具有抗炎,抗癌,抗氧化应激和抗凋亡作用。我们的研究假设认为自噬参与了糖皮质激素环境下BMSCs应激的过程,我们试图阐释自噬在此环境下发挥的功能并应用一种相对安全且有特异性的小分子化合物通过调控自噬保护受损伤的BMSCs,以期探索一种预防和治疗GIOP的新策略。研究方法将原代大鼠BMSCs培养至第3代后,分别加入三种不同剂量的地塞米松(Dex),使三个处理组培养基中地塞米松的终浓度分别达到10-8 M,10-7 M,10-6 M。加入后处理48h。对照组使用不做任何处理的普通培养基。通过透射电镜观察自噬小体。使用LC3免疫荧光细胞化学,LC3蛋白免疫印迹等方法检测细胞自噬水平。自噬功能检测实验中,加入自噬抑制剂3甲基腺嘌呤3-MA处理的终浓度为5 mM。加入自噬激动剂雷帕霉素Rapamycin的终浓度为10 nM。3-MA与Rapamycin均在地塞米松处理24h后加入。将BMSCs以每孔2.5×105个接种到6孔板上,待细胞长满后,弃掉培养基,加入Dex使培养基终浓度为10-6 M,培养24 h。再加入含浓度0μM(空白对照组,Control),50μM,100μM或200μM的TMP无血清培养基至孔板中,培养48 h。应用Cell Counting Kit-8检测液检测细胞增殖活力。使用流式细胞仪Annexin V/PI双染、TUNEL试剂盒染色及Caspase-3活性检测等方法检测细胞凋亡情况。将BMSCs接种到6孔板上,长满后加入配制好的成骨诱导液(高糖DMEM培养基,β-甘油磷酸钠,抗坏血酸,10-8 M地塞米松,10%胎牛血清,1%青链霉素)培养。诱导培养至第14天,除对照组外加入10-6 M地塞米松处理24 h,再分别给予0μM,50μM,100μM,200μM的TMP处理48 h。行碱性磷酸酶染色检测ALP活性。同时提取细胞总RNA,应用荧光实时定量PCR进行成骨分化相关基因Alp、Col1a1、Ocn、Osx的表达水平检测。诱导培养至第21天,茜素红染色检测钙沉积情况。应用自噬流阻滞剂巴弗洛霉素A1(Baf)并检测p62蛋白的表达来研究TMP对Dex处理下BMSCs自噬流的影响。将BMSCs接种到6孔板上,加入Dex使培养基终浓度为10-6 M,培养24 h。再加入含浓度0μM,50μM的TMP或100 nM的Baf无血清培养基至孔板中,培养48 h。接着用Western-blot检测了LC3及p62蛋白的表达。我们还在加入了AMPK通路抑制剂Compound C后,检测磷酸化AMPK,总AMPK,磷酸化mTOR,总mTOR蛋白的表达水平变化从而研究TMP调控自噬的信号通路。将SD大鼠置于实验室条件下,即通气良好的20°C恒温环境中,每12小时光照与黑暗交替,水粮足量,自由取用。适应1周后,每天腹腔注射等体积的蒸馏水(对照组,Control,n=10)或2.5 mg/kg泼尼松龙(n=30),持续12周。首次注射后一周开始,将30只注射泼尼松龙的大鼠随机分成3个实验组,每天分别增加注射等体积的芝麻油(安慰剂对照,即糖皮质激素性骨质疏松模型组,n=10),5 mg/kg(n=10)或20 mg/kg(n=10)的TMP溶液。持续注射12周后采用脱颈法处死取材。动物模型给药完成大鼠脱颈处死前的第12天和第2天,以5 mg/kg剂量腹腔注射钙黄绿素进行荧光素标记。留取左侧股骨固定后进行硬组织塑料包埋并切片。应用骨形态学测量系统软件计算矿盐沉积率(Mineral apposition rate,MAR),矿化面积与骨面积比例(Mineralizing surface/bone surface,MS/BS)以及骨形成率(Bone formation rate,BFR)。给药完成大鼠脱颈处死后留取每只大鼠的右侧股骨和第四椎骨,固定后进行显微CT扫描。应用软件重建兴趣区域3D图像并定量分析骨密度(BMD),相对骨体积分数(BV/TV),骨小梁数量(Tb.N),骨小梁厚度(Tb.Th),结构模型指数(SMI)和骨小梁分离度(Tb.Sp)等参数。注射给药干预12周后,分别从各组大鼠股骨与胫骨中提取BMSCs进行原代培养,收集培养第一代细胞。流式细胞仪Annexin V-FITC/PI,Caspase-3活性检测细胞凋亡。透射电镜检测自噬小体,Western-blot检测LC3蛋白检测细胞自噬水平。研究结果1.我们的数据显示,从糖皮质激素性骨质疏松大鼠中直接提取的BMSCs的增殖能力下降,同时在模型体内提取出的BMSCs中观察到自噬小体增多的现象。2.三种剂量(10-8 M,10-7 M,10-6 M)的地塞米松均可以显著促进BMSCs自噬的发生。10-8 M和10-7 M浓度的地塞米松并不影响BMSCs的增殖活力。而10-6 M剂量组则使BMSCs活力明显降低。应用了自噬抑制剂3-MA和自噬激动剂Rapa后,结果显示自噬缓解了高浓度地塞米松对BMSCs增殖活力的抑制作用,抑制了地塞米松引起的BMSCs凋亡。3.我们发现50μM的TMP能够进一步显著上调地塞米松暴露下BMSCs的自噬强度,同时抑制地塞米松引起的细胞凋亡。而TMP的这种抗凋亡效果正是由于其对自噬的调控作用所介导的。TMP本身并不能提高BMSCs的基础自噬水平,其调控自噬的效应是严格与糖皮质激素处理的应激环境相关联的。加入AMPK抑制剂Compound C后的检测结果进一步阐明了TMP对BMSCs自噬的调控作用是通过AMPK/mTOR信号通路介导的。此外,TMP处理组(50μM,100μM,200μM)与单独地塞米松处理组相比显著增加了BMSCs成骨分化过程中的ALP活性和钙结节矿化程度,同时上调了成骨相关基因ALP,COL1A1,OCN和OSX的表达水平。4.体内实验结果证实TMP体内注射干预12周能够加速糖皮质激素性骨质疏松大鼠骨形成并改善骨量丢失。TMP注射干预组大鼠体内提取的第一代BMSCs与单纯糖皮质激素性骨质疏松大鼠组相比,凋亡率明显减少而LC3-II/LC3-I比率显著提高,表现出更强的自噬水平。说明TMP能够作用于体内糖皮质激素环境下的BMSCs。研究结论综上所述,糖皮质激素能够诱导BMSCs自噬发生,自噬能够维持BMSCs增殖活力并抑制高浓度糖皮质激素造成的凋亡,在糖皮质激素刺激的应激环境下扮演保护细胞的角色。TMP能够体外在地塞米松暴露下通过AMPK/mTOR通路介导上调BMSCs自噬水平从而抑制凋亡。TMP体内注射干预能够加快GIOP大鼠骨形成,改善骨量丢失。作用于BMSCs使其自噬水平升高,凋亡减少是TMP改善GIOP大鼠骨量的机制之一。我们的研究首次探索了通过对自噬流的调控来保护糖皮质激素环境下BMSCs的新策略。TMP有成为以自噬为靶点的特异性药物的应用前景,为糖皮质激素性骨质疏松症的预防和治疗提供新的方向。