川牛膝(Cyathula officinalis Kuan.)为苋科(Amaranthaceae)杯苋属(CyathulaBlume)植物,别名甜膝,为多年生草本植物。川牛膝主要分布于四川,云南和贵州,野生或栽培,生长于海拔1500米以上的地区,以四川雅安的天全、宝兴、汉源和乐山地区的金口河区产量最大,资源十分丰富。其中,又以天全川牛膝最为有名。川牛膝的主要成分为甾醇类物质,如杯苋甾酮、异杯苋甾酮和头花杯苋甾酮等,其主要的药理作用有活血通经、祛风湿、通利关节、利尿通淋以及对治疗高血压性心脏病和痛经作用等。道地产区川牛膝在长期栽培的过程中,由于天然杂交、品种混杂等原因,种内产生多种变异,品种退化、品质下降,甚至出现伪品。
本研究在川牛膝产区广泛收集川牛膝种质资源,从形态学、细胞学、分子水平上研究其遗传多样性,为合理保护和利用,寻找高产、优质的种质资源奠定基础,同时建立鉴别川牛膝及其伪品的有效方法,其主要结果如下:
1、对16份不同来源川牛膝种质的株高、茎粗、分枝数、根长、根粗、分根数、第2叶长、第3叶长、第2叶宽、第3叶宽、根重等性状进行了方差分析,结果表明这些种质材料存在着丰富的遗传多样性;并根据种质之间差异显著的茎粗、根长、根粗、分根数和根色等5个形态指标对16份川牛膝种质进行了比较形态学研究和数量分类,其结果基本能反映川牛膝种质种间的形态学差异,为鉴定川牛膝种质资源提供了可行的形态学评价指标。
2、细胞学观察结果表明,所收集的川牛膝种质材料的染色体数目均为34,为二倍体;其核型公式多样,最长染色体:最短染色体(L:S)比值在1.49-4.31之间,核型不对称系数在61.89-67.59之间,呈现丰富的染色体形态多样性;最长染色体:最短染色体(L:S)比值在白牛膝和红牛膝两种类型中存在明显差异,根据最长染色体与最短染色体的长度比值将收集的11份川牛膝材料大致区分为两类:第1、2、3、4、5、7、8、9、11号九种材料介于1.10-3.00之间,为白牛膝;第6、10号两种材料大于3.01,为红牛膝。
3、利用特异性PCR技术对19个川牛膝种群的r DNA ITS区域碱基序列进行测定,序列比对后在GenBank中进行同源性搜索发现,17、18号材料ITS区序列与怀牛膝的ITS区吻合一致,其余17个材料均与川牛膝ITS区序列相同或相似。川牛膝和怀牛膝ITS1-5.8S-ITS2序列长度为586-590bp,去除序列长度为162bp的5.8S,ITSI+ITS2排序后的长度为424-428bp。川牛膝与怀牛膝ITS区域碱基序列有明显差异,但不同产地、不同栽培品种的川牛膝种质资源间碱基序列仅存在几个碱基的差异,表明ITS能鉴别出川牛膝与混淆品怀牛膝,而无法准确地鉴别亲缘关系本身较近的川牛膝(白牛膝)和红牛膝。17份川牛膝种质间遗传差异较小,这可能与ITS序列分析适用的分类阶元有关。
4、应用RAPD标记分析了19个川牛膝种群的遗传多样性。结果表明,23个引物共扩增出419个RAPD位点,其中多态位点377个(90%);UPGMA聚类分析表明,19个材料可聚为两个大类、三个亚类。RAPD标记显示川牛膝种质资源在分子水平上确实具有丰富的遗传多样性,利用RAPD标记不仅能解决川牛膝栽培种混杂的问题,也能作为构建川牛膝DNA指纹图谱的有效工具。
5、在川牛膝RAPD指纹图谱基础上,从中找到可区分川牛膝与怀牛膝、红牛膝与白牛膝的特异RAPD标记多态性谱带F300、F500进行测序,根据序列设计出特异性引物进行特异DNA片段的PCR扩增,通过回收、克隆、测序,将RAPD标记转化为更为稳定的SCAR标记。获得的SC-320 SCAR标记能稳定地在川牛膝与怀牛膝中鉴定出商品川牛膝(白牛膝与红牛膝),另一个SC-495 SCAR标记则能稳定有效地在商品川牛膝中鉴定出白牛膝。构建了利用SCAR标记鉴定川牛膝及其混淆品的新途径。
综上所述,对川牛膝种质资源进行形态学、细胞学、分子水平上的研究比较,能进一步了解其种质资源遗传多样性,这为开展川牛膝的良种繁育、新品种选育、提纯复壮及伪品鉴别等工作奠定了坚实的理论基础。本研究结果在形态学上为今后川牛膝的选育提供了主要特征性状指标;细胞学研究推测核型的最长染色体:最短染色体的比值可作为区分红白牛膝的依据;利用RAPD分子标记检测到较高水平的种质资源多态性,可作为构建川牛膝种质资源DNA指纹图谱的有效工具;利用ITS序列的保守性及转化SCAR标记,为鉴别川牛膝及其混淆品提供了行之有效的新途径。
